研究背景与目的对肿瘤的发病,进展机制及其治疗的研究已有数十年时间,人们对于肿瘤的认知由宏观到微观,由细胞到分子,由信号通路到基因调控,越来越多的证据证明肿瘤的发生与基因调控密切相关,目前的主流观点认为:肿瘤本质上是一种基因疾病。肿瘤的发生与发展是一个多步骤逐渐演进的过程,而整个过程的核心步骤就是致癌基因获得功能性突变以及抑癌基因去功能性突变的发生。抑癌基因(tumor suppressor genes)是一类存在于正常细胞内可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。抑癌基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负调节作用,它与致癌基因相互制约,维持正负调节信号的相对稳定。而近年来关于肿瘤的机制尤其治疗方面的研究热点多集中于致癌基因,其中许多研究成果已经投入实际临床应用,如格列卫等靶向药物,已经取得了一定的临床治疗效果,而针对抑癌基因的研究较少,目前仅有少量研究处于向治疗转化的摸索阶段。我们认为,在肿瘤研究领域,如果想要取得更进一步的研究进展,关于抑癌基因的研究更加需要我们的投入和关注。包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白(Transmembrane and immunoglobulin domain containing,TMIGD)家族是由本人所在实验室新发现的一类包含免疫球蛋白(Ig)结构域的细胞表面黏附分子(Immunoglobulin-like cell adhesion proteins,Ig-CAMs)。TMIGD蛋白是一种细胞表面糖蛋白,由包含一个或多个免疫球蛋白样结构域的胞外段,一个单次跨膜结构域,以及C端胞内段三部分组成。目前该家族已发现的蛋白成员共有3个。TMIGD家族的第一位成员也是由本人所在实验室发现,我们称之为包含免疫球蛋白结构域的富脯氨酸受体-1(Ig containing and proline-rich receptor-1,IGPR-1,也称为 TMIGD2)。IGPR-1 在内皮细胞中的表达主要调控细胞间黏附,细胞的屏障功能以及血管新生,并且最近我们还发现了其具有一定的促进肿瘤细胞生长的作用。最近该家族的第三个成员——包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白 3(transmembrane and immunoglobulin(Ig)domain containing 3,TMIGD3)也被发现。Swathi及他的研究团队在他们的研究中发现TMIGD3在骨肉瘤中可以发挥肿瘤抑制因子的作用,并通过抑制PKA-Akt-NF-kB通路的激活,抑制骨肉瘤细胞的增殖,迁移侵袭以及其对外界不良条件刺激的耐受能力。TMIGD1是本课题组发现的TMIGD蛋白家族的第二个成员,该蛋白编码序列位于17号染色体,由7个外显子编码262个氨基酸。此前我们发现,IGPR-1在人类及其他种类动物中有表达,但在小鼠基因组中没有表达,而TMIGD1蛋白在人类及小鼠基因组中均有表达,且氨基酸序列具有高度的同源性。TMIGD1蛋白的胞外结构域包含两个免疫球蛋白样结构域,随后为单次跨膜结构域及一个很短的胞内结构域。而TMIGD1与IGPR-1的一项主要不同点就是TMIGD1的胞内结构域明显较短,且不含有类似IGPR-1的脯氨酸富集段。此外,TMIGD1的胞外段含有两个免疫球蛋白样结构域,而IGPR-1只含有一个。在具体组织中,TMIGD1在人类及小鼠的肾脏组织中高表达,主要表达于近端小管与远端小管上皮细胞中,而在足细胞中未测及表达。TMIGD1在脑,胃,小肠及结肠上皮组织中也有一定程度的表达,而在其他组织中的表达明显低于以上组织。前期研究中我们发现,TMIGD1通过其免疫球蛋白样结构域在细胞间形成同源二聚体,进而介导细胞间的黏附作用。过表达TMIGD1的HEK293细胞在细胞黏附实验中能够形成更大的细胞团,而将其与转染空质粒的细胞混合后可明显减少大细胞团块的形成。此外,过表达TMIGD1可使细胞的跨膜电阻(Trans Epithellal Electric Resistance,TEER)升高,胞膜通透性降低,使细胞内的肌动蛋白纤维向胞膜集中排列。在过表达TMIGD 1的HEK293细胞系中,细胞增殖及细胞迁移运动均明显受到抑制,而TMIGD1可明显增强肾上皮细胞对缺氧及营养缺乏的耐受性。在小鼠肾动脉高压及缺血再灌注损伤模型中,TMIGD1在损伤后均呈一过性表达上调。综合上述发现,TMIGD1作为Ig-CAM,能够通过其胞外段与不同配体相互结合,形成连接结构以稳定细胞膜结构,进而强化细胞膜以及细胞所组成上皮结构的屏障功能,限制肾小管上皮细胞的增殖及运动,同时起到增强肾上皮细胞对环境不利因素抗性的作用。此外,我们还发现TMIGD1在多种肿瘤细胞中表达下调。综合此前研究发现,我们推测TMIGD1在肿瘤细胞中有可能作为肿瘤抑制因子发挥作用。由于TMIGD1在肾脏组织中的表达明显高于其他组织,且TMIGD1在肾脏恶性肿瘤细胞系中表达均有所降低,加之TMIGD1在肾上皮细胞中的保护作用已经在此前研究中被证实。因此在本研究中,我们首先选取肾癌细胞系,研究TMIGD1在肿瘤细胞中的表达情况及其所发挥的作用,并通过ActiveSignal Assay检测探寻TMIGD1发挥作用所调控的信号通路,通过LASAGNA-Search 2.0启动子活性分析技术研究TMIGD1表达调控的机制;由于TMIGD1在胃,小肠,结肠等消化道上皮组织中也有较高的表达,因此我们选取结肠癌细胞,在其中进一步验证TMIGD1的抗肿瘤作用,并通过液相色谱质谱联用技术(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)进一步探寻与 TMIGD1 相互作用的上下游信号分子,证明其肿瘤抑制因子的作用并尝试阐明其发挥作用的机制,为TMIGD1作为临床肿瘤早期诊断标志物提供参考和依据,为其在未来应用于抑癌因子靶向治疗提供思路和启发。第一部分 包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白1通过调控p21Cip1/p27Kip1在肾癌细胞中发挥抑癌因子作用及其机制的研究材料与方法1.提取人类及小鼠各类组织中mRNA及蛋白,通过qPCR及western blot检测TMIGD1在人类及小鼠各类正常组织中的表达情况。对正常肾脏组织切片进行免疫组化染色,观察TMIGD1在肾脏组织中的表达情况。通过对TCGA肾细胞癌数据库数据进行收集分析,分析肾细胞癌组织中TMIGD1表达情况。通过qPCR及western blot对人类肾癌细胞系中TMIGD1表达情况进行检测。对临床肾癌病例组织切片进行免疫组化染色分析其中TMIGD1表达情况的变化。2.通过逆转录病毒在肾癌细胞系中过表达TMIGD1,然后通过鬼笔环肽染色观察过表达TMIGD1后肾癌细胞形态变化。通过MTT及BrdU细胞增殖实验比较转染TMIGD1前后肾癌细胞增殖能力变化。利用裸鼠皮下成瘤实验比较转染前后肾癌细胞成瘤能力的差别。通过体外3D分枝化形态发生实验及transwell实验分析转染TMIGD1后肾癌细胞迁移侵袭能力的变化。3.利用Active Signal Assay分析检测转染TMIGD1后肾癌细胞内各肿瘤相关信号通路的变化情况。并通过western blot对检测结果进行验证。4.利用LASAGNA-Search 2.0系统预测TMIGD1可能相关的转录因子,并通过电泳迁移率变动分析实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)验证预测所得的转录因子是否能够与TMIGD1的启动子序列物理结合。通过启动子活性检测技术检测分析所得转录因子是否能够上调TMIGD1的表达。5.分别检测分析所得转录因子在肾癌细胞系及肾癌病理组织切片中的表达情况,并与组织中TMIGD1的表达情况进行类比分析。在肾癌细胞系中过表达上述转录因子,通过qPCR及western blot检测TMIGD1表达情况变化。通过分枝化形态发生实验检测转染转录因子后,肿瘤细胞恶性生物学行为的变化。结果1.在人类组织芯片中,TMIGD1的mRNA水平在肾脏组织中最高,其次为脑组织,然而包括脑组织在内,TMIGD1的mRNA在卵巢,心脏,血管,肺,肝脏,胰腺,骨髓以及皮肤等其他组织中的表达水平均明显低于肾脏。Western blot结果与qPCR结果基本一致。在小鼠组织中的表达情况与人类组织相似,肾脏组织中TMIGD1 mRNA 水平明显高于其他组织,另外在胃,肠道以及唾液腺组织中也有测及,但低于肾脏组织。正常肾脏组织切片免疫组化染色显示TMIGD1主要表达于肾小管上皮细胞,而足细胞无表达。在网络数据库搜集的病例样本中,肾乳头细胞癌占293例,嫌色细胞癌66例,透明细胞癌499例,对所有收集病例进行分析显示TMIGD1在肾癌中表达均下调。在所检测人类肾癌细胞系中,TMIGD1 mRNA及蛋白水平均明显低于正常肾脏组织。在所检测的24例肾癌病理切片中,TMIGD1在恶性肿瘤组织中的染色明显低于周围正组织及良性肾脏疾病组织。2.在人肾癌细胞系786-0细胞中过表达TMIGD1后,鬼笔环肽染色显示细胞形态发生变化,且肌动蛋白排布方式呈现非对称型,细胞出现极性,伪足装结构减少。MTT及BrdU增殖实验显示转染TMIGD1后786-0细胞增殖明显减慢。裸鼠皮下成瘤实验结果显示转染TMIGD1后,786-0细胞成瘤能力明显降低。体外3D分枝化形态发生实验及transwell实验结构显示转染TMIGD1后,786-0细胞迁移侵袭能力受到明显抑制。3.通过Active Signal Assay分析检测平台对转染TMIGD1的肾癌细胞系786-0内的20余条肿瘤相关信号通路,70余种蛋白的变化情况进行分析。发现受到TMIGD1影响的蛋白主要与细胞周期及细胞增殖信号通路相关。其中上调最显著的为p21CIP1蛋白与p27KIPI蛋白。此外,TMIGD1还可减低周期蛋白D1(CyclinD 1)以及周期蛋白依赖激酶 1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1/Cdc2)的磷酸化,并可以促进视网膜瘤蛋白(Rb)以及p38MAPK(MAPK14)的磷酸化。加用p38MAPK抑制剂SB203580后,上述过表达TMIGD1后出现的细胞信号因子改变均被逆转。4.将TMIGD1编码区上游1241对碱基序列克隆入绿色荧光蛋白(GFP)报告质粒Zgreen中后,转染HEK-293细胞,转染TMIGD1上游序列的细胞系表现出9%转录激活强度,转录对照组质粒的HEK293细胞表现出49.8%转录激活强度。利用LASAGNA-Search 2.0系统对TMIGD1上游非编码区碱基序列进行预测分析,系统提示该段序列内含有多个CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancerbinding protein,C/EBP)结合位点,推测 C/EBP β可能为调控TMIGD1的潜在转录因子。通过电泳迁移率变动分析实验(EMSA),证明C/EBPβ能够与TMIGDI上游核酸序列物理结合。将C/EBPβ激活形式肝脏激活蛋白(Liver Activating Protein,LAP)与启动子活性检测质粒共同转染入HEK-293细胞后,荧光强度增强90%。将C/EBP β灭活形式肝脏抑制蛋白(Liver Inhibiting protein,LIP)与启动子活性检测质粒共同转染后,荧光强度受到抑制。5.Western blot结果显示,在人类肾癌细胞系786-0,DLD1以及TK10中,LAP与TMIGD1表达均极低或无法测及,而在正常人肾小管上皮细胞中二者均呈阳性表达。在人类肾癌组织切片中,肿瘤组织区域LAP及TMIGD1的表达均明显降低,而肿瘤周围正常组织二者均呈阳性表达。且二者的表达减低具有明显相关性。在786-0中转染过表达LAP后,qPCR及western blot结果均显示TMIGD1表达上调。且分枝化形态发生实验结果显示,转染LAP后,786-0细胞分枝化结构明显减少。结论1.TMIGD1在人类及小鼠组织中以肾脏组织表达最高,其次为脑及消化道上皮组织。在正常肾脏组织中,,TMIGD1主要表达于肾小管上皮细胞,足细胞无TMIGD1表达。TMIGD1在肾癌组织及细胞中表达均明显降低。2.TMIGD1可改变肾癌细胞内肌动蛋白的排列方式,抑制肾癌细胞的增殖,肿瘤形成以及迁移侵袭等恶性生物学行为。3.TMIGD1通过促进p38磷酸化,及一系列信号传导,最终起到抑制肾癌细胞恶性生物学行为的作用。4.C/EBPβ通过与TMIGD1上游非编码区的结合位点直接结合,调控TMIGD1的表达,其激活形式LAP可显著上调TMIGD1表达,而其抑制形式LIP可明显抑制TMIGD1的表达。5.C/EBPβ通过调控肾癌细胞中TMIGD1的表达情况,调控肾癌细胞的恶性生物学行为。第二部分包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白1通过抑制CYR61在结肠癌细胞中发挥抑癌因子作用及其机制的研究材料与方法1.通过对TCGA结肠癌数据库数据进行收集分析,分析结肠癌组织中TMIGD1表达情况。收集临床结肠癌病理组织,对病理切片进行免疫组化染色,对比癌组织与周围正常组织间TMIGD1染色情况。通过qPCR及western blot对人类结肠癌细胞系中TMIGD1表达情况进行检测。2.使用逆转录病毒在结肠癌细胞系中过表达TMIGD1,然后通过鬼笔环肽染色观察过表达TMIGD1后结肠癌细胞的形态及排布方式变化。通过MTT及BrdU细胞增殖实验比较转染TMIGD1前后结肠癌细胞增殖能力变化。通过transwell实验分析转染TMIGD1后结肠癌细胞迁移侵袭能力的变化。通过集落形成实验比较转染TMIGD1前后结肠癌细胞成瘤能力的变化。利用裸鼠皮下成瘤实验比较转染前后结肠癌细胞体外成瘤能力的差别。3.在过表达TMIGD1的结肠癌细胞系中通过western blot检测p38,p-p38,p-Rb,p21CIP1,p27KIP1蛋白的表达或磷酸化情况,以及加用p38MAPK抑制剂SB203580处理后各蛋白的变化情况。通过MTT增殖实验检测各组细胞增殖能力的变化情况。4.在结肠癌细胞中过表达C/EBPβ(LAP),通过western blot检测LAP及TMIGD1的表达情况,并通过MTT增殖实验检测各组细胞增殖能力的变化情况。5.将TMIGD1胞外段序列克隆入pGEX质粒中,转化工程菌后生产GST-E-TMIGD1融合蛋白,进行GST-pulldown实验,所得样品经SDS凝胶电泳后通过液相色谱质谱联用技术(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)进行检测分析,寻找可能存在的TMIGD1胞外段配体。将分析所得配体与TMIGD1共同转染结肠癌细胞,通过GST-pulldown及双向免疫共沉淀实验验证两种蛋白是否能够直接结合。合成配体蛋白各结构域GST融合蛋白,探究TMIGD1与其结合的具体结构域。6.分别干预配体蛋白与TMIGD1的表达,利用各组细胞进行MTT及BrdU细胞增殖实验比较各组结肠癌细胞增殖能力变化。通过transwell实验分析比较各组结肠癌细胞迁移侵袭能力的变化。通过集落形成实验比较各组细胞成瘤能力的变化。给予不同浓度外源性配体蛋白刺激,观察转染TMIGD1前后细胞对不同浓度外源性配体蛋白刺激反应的变化。结果1.对网络数据库中入组的195例结肠癌病例分析结果显示,TMIGD1 mRNA水平在入组结肠癌病例中明显降低。在所检测人类结肠癌细胞系中,TMIGD1 mRNA及蛋白水平较正常上皮细胞均明显减低。在所检测的43例结肠癌病理切片中,TMIGD1在恶性肿瘤组织中的染色明显低于周围正常组织。2.在人结肠癌细胞系RKO,HCT116细胞中过表达TMIGD1后,鬼笔环肽染色结果显示,表达TMIGD1的HCT116及RKO细胞,细胞形态更加规则,在相似密度下表达TMIGD1的细胞较对照组细胞形成较少的细胞间连接,尤其通过伪足状结构形成的细胞间连接明显减少。MTT及BrdU增殖实验显示转染TMIGD1后,结肠癌细胞的增殖明显受到抑制。Transwell及集落形成实验结果显示转染TMIGD1后,结肠癌细胞系RKO及HCT116的迁移侵袭及体外成瘤能力受到明显抑制。裸鼠皮下成瘤实验结果显示转染TMIGD1后,RKO及HCT116细胞的体外成瘤能力明显降低。3.在过表达TMIGD1的结肠癌细胞系RKO中,western blot结果显示p-p38,p-Rb,p21CIP1,p27KIP1蛋白的量升高,p38表达量未见明显变化,加用p38MAPK抑制剂SB203580处理后,此前p-Rb,p21CIP1,p27KIP1的升高被逆转,p-p38与p38无明显变化。MTT增殖实验结果显示,SB203580对未转染TMIGD1的结肠癌细胞RKO的增殖能力无明显影响,转染TMIGD1后,SB203580处理RKO细胞可明显逆转由转染TMIGD1所引起的细胞增殖能力下降。4.在结肠癌细胞RKO中过表达C/EBPβ(LAP)后,western blot检测结果显示LAP及TMIGD1的表达均上调,MTT增殖实验显示转染LAP的结肠癌细胞RKO增殖能力受到明显抑制。5.对GST-pulldown实验样品进行LC-MS/MS质谱分析,所得结果提示富半胱氨酸蛋白 61(cysteine rich angiogenic inducer 61,CYR61/CCNI)有可能为TMIGD1的胞外配体。将CYR61与TMIGD1共同转染结肠癌细胞HCT116,通过GST-pulldown实验及双向免疫共沉淀实验验证两种蛋白能够直接相互结合。分别合成CYR61四个不同结构的GST融合蛋白,并通过GST-pulldown实验证实CYR61通过第二个结构域,即假性血友病因子样结构域(Von Willebrand Factor-likemodule,VWC)与 TMIGD1 胞外段相互结合。6.单独干扰CYR61表达后,HCT116及RKO细胞的各类恶性生物学行为均有一定程度减低,而在过表达TMIGD1后,结肠癌细胞如之前实验,其增殖,迁移侵袭以及成瘤能力能力均受到抑制,而此时再干扰CYR61的表达对结肠癌细胞的各项恶性生物学行为并无进一步抑制作用。在过表达TMIGD1并干扰CYR61表达的RKO细胞系中,给予不同浓度的外源性CYR61刺激,两组细胞的增殖能力呈现错峰式上升。结论1.TMIGD1在结肠癌细胞系及结肠癌病理组织中表达均减低。2.TMIGD1能够抑制结肠癌细胞的增殖,肿瘤形成以及迁移侵袭等恶性生物学行为。3.TMIGD1胞外段能够特异性地与CYR61蛋白的VWC结构域结合,抑制CYR61促进结肠癌细胞各项恶性生物学行为的作用。意义1.首次发现了 TMIGD1蛋白在肾癌及结肠癌细胞中能够抑制肿瘤细胞的增殖,成瘤以及迁移侵袭等恶性生物学行为的作用,明确了其作为抑癌因子的价值;2.阐明了 TMIGD1在肾癌细胞中通过促进p38磷酸化,进而调控CyclinD1,Rb,p21CIP1以及p27KIP1等信号分子,最终调控肾癌细胞恶性生物学行为的作用机制;发现了 C/EBPβ作为上游转录因子调控TMIGD1的表达;证明了TMIGD1在结肠癌细胞中可通过其胞外段与CYR61蛋白结合,进而抑制CYR61蛋白的促癌作用,发挥肿瘤抑制因子的作用;3.首次证实TMIGD1肿瘤抑制因子的作用,并初步阐明了其发挥作用的机制,证明TMIGD1具有作为抑癌因子用作临床肿瘤早期诊断标志物的潜在价值,其抑癌作用也可以为临床恶性肿瘤的靶向治疗提供参考和思路。