番茄SlGRAS1基因的克隆及功能研究

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转录因子(Transcription factor,TFs)通常也也称为反式作用因子,能够与基因启动子区域的顺式作用元件特异性结合,激活或抑制下游基因的转录表达,从而达到调控基因表达的目的。  GRAS蛋白家族作为高等植物特有的转录因子,据报道在赤霉素信号通路、分生组织的维持和光敏色素信号通路等重要的生理过程以及植物抗逆过程中发挥重要的生理功能。该蛋白家族通常由400-770个氨基酸组成,羧基端高度保守,氨基端在序列长度和种类上复杂多变,同时决定着蛋白独有的功能。迄今为止,大部分GRAS蛋白家族成员的功能尚未报道。  本研究以番茄(Solanum lycopersicum)为材料,对GRAS家族成员SlGRAS1进行研究。首先从番茄基因组中克隆了SlGRAS1基因,分析了基因结构、启动子区域以及蛋白物理性质和结构特征,构建了GRAS蛋白家族的系统发生树;采用Real-time PCR方法研究了番茄SlGRAS1基因的时空表达模式以及非生物胁迫、外源激素的响应情况;构建了超表达载体和反义表达载体,通过农杆菌介导番茄的遗传转化,获得了相应的转基因植株,并进行形态学观察分析以及与成熟相关基因的表达量检测。初步分析了番茄SlGRAS1基因在番茄生长发育过程中的生物学功能。本研究得到的主要结果如下:  一、运用生物信息学分析发现,番茄SlGRAS1基因全长1629bp,编码542个氨基酸,具有典型的GRAS家族特征;启动子区域分析发现,该区域具有许多功能元件,如光应答元件、逆境应答元件和激素应答元件。  二、蛋白预测分析发现SlGRAS1蛋白的分子量和等电点分别为60.5KDa和5.52,预测可能为不稳定的脂溶性亲水蛋白,无信号肽和跨膜区域,因此不是分泌蛋白和膜蛋白。根据系统发生树分析,SlGRAS1属于PAT1亚家族,与AtSCL13具有83%的氨基酸序列相似性。  三、该基因的组织特异性表达分析发现,番茄SlGRAS1基因在花和茎中表达量较高,在果实坐果到成熟过程中,SlGRAS1基因在坐果和破色期表达量明显高于其他时期。逆境胁迫响应中,低温和高温处理对SlGRAS1基因的表达影响较大,氧胁迫、渗透压胁迫和盐胁迫对基因表达影响相对较小。外源激素响应分析显示,SlGRAS1基因的表达在转录水平上受到这些激素的调控,其中外源施加生长素(Indole-3-acetic acid,IAA)和乙烯使得SlGRAS1基因的表达水平显著上调。  四、构建超表达载体K303-35S-SlGRAS1-GFP和干扰抑制载体pCambia1301-AsSlGRAS1,并通过农杆菌介导转入番茄中获得了超表达阳性植株,以野生型为对照,我们通过对T1代和T2代超表达转基因植株进行了统计分析,发现SlGRAS1超表达植株具有株高变高,节间距伸长以及果实成熟推迟的表型。  五、对果实成熟周期延长的现象研究中,我们选取了超表达转基因植株四个不同发育时期MG,Br,Br+4,Br+7的果实,提取RNA反转录成cDNA,同时筛选了与成熟相关的重要的基因,通过Real-time PCR方法对其在转基因植株果实中的表达量进行了相对定量分析,发现超表达SlGRAS1基因影响了番茄成熟相关基因的表达水平,如RIN、NOR、ACO1和PSY1,整体呈现下调趋势,在一定程度上影响了乙烯的合成和番茄红素的积累,从而导致了番茄果实成熟的推迟。
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