新型番鸭细小病毒的分离与鉴定

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番鸭“白点病”(MuscovyDuckWhiteNecrosis,MDW)是1997年以来,开始在国内流行的新型疫病。该病以发病番鸭肝脏、脾脏表面散布白色坏死小灶为主要特征。本研究对出现典型“白点病”的番鸭肝脏、脾脏进行病毒和细菌的分离培养,传代纯化,易感动物攻毒试验,对病毒的成功蚀斑克隆纯化以及用克隆纯化毒成功复制此病,证明该病病原为病毒,命名为MDPV0401(MuscovyDuckParvovirus0401)。通过理化特性研究,核酸类型鉴定,红细胞凝集试验以及琼脂扩散试验,证明该病毒具有细小病毒的系列特征;对该病毒的尿囊液超离物进行蔗糖梯度离心纯化,纯化物进行负染后,在电子显微镜下观察,观察到了一种直径为25nm左右的病毒,纯化后的病毒粒子进行动物回归试验,证明该病毒可以引起雏番鸭肝、脾、肠道出现典型的白色坏死小灶;用表现典型病理变化的病理组织制作超薄切片,进行透射电镜观察,再次观察到了25nm左右的病毒颗粒;对病理组织进行石蜡切片观察,发现肝脏和脾脏有不同程度的病理变化:对该病毒的全部编码基因进行扩增,并同GenBank中登录的细小病毒进行同源性比较和系统进化树的绘制,证明了该病毒和番鸭细小病毒有很近的亲缘关系,和鹅细小病毒有着较近的亲缘关系。 从病死雏番鸭肝、脾中分离病原,经番鸭胚尿囊腔盲传10代,然后进行蚀斑克隆纯化,得到一株病毒。该病毒能够复制出典型番鸭“白点病”临床症状和病理变化,并再次分离得到病毒,证明该病毒是番鸭“白点病”的病原。对所分离病毒进行理化特性的研究,证明该病毒耐酸,耐乙醚和氯仿,无囊膜,对温度敏感,但仍保持一定感染力。核酸类型的鉴定,证明该病毒核酸类型为DNA。不凝集红细胞,可以和细小病毒鸭抗和鸡抗阳性血清进行凝集反应,进一步确定该病毒为细小病毒。病毒克隆纯化毒经超速离心、蔗糖密度梯度离心提纯后,磷钨酸负染,于透射电子显微镜下观察,可以观察到病毒粒子呈六边形,无囊膜,二十面体对称,大小为25nm左右。超薄切片观察也观察到了相同的结果。对病死番鸭进行组织病理切片观察,可见肝、脾组织有不同程度的病理变化。 本研究根据病毒粒子大小、理化特性、琼脂扩散试验将其归类于细小病毒科,针对禽细小病毒编码基因设计了4对保守引物,对病毒的全部编码基因进行扩增,然后对扩增片断进行拼接,扩增片段长度为4148bp,然后对病毒的NS基因和VP基因进行分析,证明该病毒和番鸭细小病毒具有非常近的亲缘关系,基因变异位点主要位于开放阅读框的后半段;而和同样能引起番鸭“白点病”的新型番鸭细小病毒南海株的1030bp基因片断相比较,则发现基因的变化位点主要位于开放阅读框的前半段;和GenBank中发表的番鸭细小病毒(登录号:NC006147)、小鹅瘟细小病毒(登录号:NC_001701)、猪细小病毒(登录号:AY684872)、貂细小病毒(登录号:NC_001662)、人细小病毒B19(登录号:DQ408301)、牛细小病毒(登录号:NC_001504)、牛细小病毒3型(登录号:AF406967)、田鼠细小病毒(登录号:V01115)、家鼠细小病毒(登录号:NC_001630)、蛇细小病毒(登录号:NC_006148)、犬细小病毒(登录号:NC004442)、猿细小病毒(登录号:U26342)、LuⅢ(登录号:NC004713)、H1细小病毒(登录号:NC_001358)进行相应序列比较后发现,证明该病毒和灵长类、牛、犬、蛇、水禽细小病毒来自共同的祖先,但和番鸭细小病毒的亲缘关系最近。 综上所述,本研究分离到一株新的番鸭细小病毒,该病毒可以引起典型番鸭“白点病”的临床症状和病理变化。目前国内外已有的同类病症报道病原还有呼肠孤病毒,疱疹病毒等,因鸭病毒性肝炎存在一病多病原先例,因此推测番鸭“白点病”也有多种病原存在的可能性。
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