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芋螺属于海洋肉食性软体动物,全世界大约有700种,主要分布在热带和亚热带海域。芋螺可以通过分泌毒液来捕食猎物和防御天敌。每种芋螺毒液中含有约2000种不同的小肽,称为芋螺毒素或者芋螺肽(Conotoxin or Conopeptide,CTx)。这些芋螺毒素具有分子量小、富含半胱氨酸、序列多变、靶点专一等特点。芋螺毒素按照信号肽序列可以分为若干个超家族:包括A、O、M、P、I、T等等。按照药理学活性,又可分为若干个亚家族。如:A-超家族(α-、αA-、κA-和ρ-Conotoxins);M-超家族(μ-、Ψ-Conotoxins);O-超家族(ω-、μO、δ-和 κ-Conotoxins);T-超家族(τ-和χ-Conotoxins)等等。芋螺毒素能特异地作用于电压门控或配体门控离子通道。其中A-超家族中的α-芋螺毒素(α-CTxs)是其中重要的一类,它们能特异地作用于乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs),并能区分不同的亚型。因此,芋螺毒素由于有望成为神经科学研究的新型工具和治疗相关疾病的新型药物,而引起了人们的广泛关注。lv1a是本实验室从海南产疣缟芋螺基因组DNA中克隆到的一种新型α-芋螺毒素前体基因,它编码产生的成熟肽LvIA的氨基酸序列为:GCCSHPACNVDHPEIC#(#,C-末端酰胺化)。本实验室前期研究发现,α-芋螺毒素LvIA是α3β2乙酰胆碱受体(nAChRs)的高活性强阻断剂,并对α3β2和α6/α3β2β3,以及α3β2和α3β4这两对nAChRs相似亚型之间具有很好的区分度。LvIA属于α4/7型芋螺毒素,与以往发现的4/7型芋螺毒素具有一定的相似性。通过化学合成线性肽及其两步法氧化折叠,获得了 α-芋螺毒素LvIA活性肽及其一系列突变体,并对这些多肽的药理学作用靶点进行了研究。利用非洲爪蟾卵母细胞表达体系,制备乙酰胆碱受体(nAChRs)不同亚基的cRNA,然后将其注入非洲爪蟾卵母细胞内,使其在细胞膜上表达了 nAChRs的不同亚型。通过这种方法,构建了人源(human,h)和鼠源(rar,r)α3β2,α3β4,α7,α9α10等共20种受体表达模型。利用该模型对α-CTx LvIA及其突变体的药理学靶点结合活性进行了系统研究。利用丙氨酸(Ala)扫描技术,对LvIA中的关键氨基酸进行了研究。当序列中第5位的组氨酸(His)和第6位的脯氨酸(Pro)被丙氨酸(Ala)取代后,LvIA的活性完全丧失;当序列中第12位的His被Ala取代后,LvIA的活性大大减弱;当第9位的天冬酰胺(Asn)和第11位的天冬氨酸(Asp)被Ala取代后,LvIA突变体对rα3β2 nAChRs的活性增强。LvIA突变体LvIA(N9A)和LvIA(D11A)对rα3β2的半阻断剂量分别为2.14 nM和11.35 nM。LvIA(N9A)对nAChRs不同亚型的分辨率也有所提高。针对第9和11位,设计了第2代突变体,发现当第9位的天冬酰胺(Asn)被精氨酸(Arg)取代后,LvIA突变体对α3β2 nAChRs的活性增强,半阻断剂量为2.12nM,同时LvIA(N9R)增加了对rα7nAChRs的作用,半阻断剂量为98.6nM。研究还发现LvIA中的丝氨酸-组氨酸-脯氨酸-丙氨酸(Ser-His-Pro-Ala,SHPA)保守性结构对包括LvIA在内的α4/7-CTxs的活性至关重要。研究了 LvIA中氨基酸修饰对其活性的影响。发现第6位的Pro羟基化修饰后,LvIA对nAChRs所有的亚型活性丧失;第13位的Pro羟基化修饰后,LvIA对rα3β2 nAChRs的活性减弱,半阻断剂量为51.92 nM,但是对rα3β4 nAChRs的活性变化不大。另外C-末端酰胺化修饰,不仅对LvIA活性有所影响,也影响了 LvIA的氧化折叠效率。失去C-末端酰胺化修饰,LvIA对rα3β2和rα3β4 nAChRs的IC50变化为298.8 nM和1.65 μM,活性比原来降低了 10倍。利用串联表达技术,构建原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达了芋螺毒素LvIA。lv1a成熟肽基因位于ksi基因的下游和his6基因的上游,在大肠杆菌中高效表达了KSI-(LvIA)n-His6融合蛋白,并通过Ni亲和层析对表达蛋白进行了纯化。通过溴化氰切割和纯化,最终1L菌液可获得纯度高达95%的重组α-芋螺毒素LvIA(rLvIA)40 mg。通过小鼠热板实验和电生理实验对rLvIA的活性和靶点进行了验证。结果表明,rLvIA具有较好的镇痛活性。该方法不仅为LvIA的低成本制备提供了一种新的途径,也为其他芋螺毒素小肽的重组表达提供了有效借鉴,对于今后芋螺毒素药物的研发具有重要意义。综上所述,本研究利用分子生物学、多肽药物化学和膜片钳电生理等多项关键技术相结合的方法,对α-CTx LvIA的突变体活性、关键氨基酸及表达方法进行了细致深入的研究,研究结果对于LvIA在神经科学研究中的应用,以及后续的新药研发工作具有重要的科学意义。