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目的:本研究在成功建立血管性痴呆(VD)小鼠动物模型基础上,观察补肾活血方对VD小鼠脑组织碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响,旨在从调节神经营养因子(NTF)表达,减轻脑缺血损伤,修复和保护神经元的角度探讨该药对VD的治疗作用机制,为临床治疗VD提供实验依据。
方法:
健康清洁级雄性昆明小鼠72只,体重35～40g,随机抽取12只作为假手术组,其余60只随机分为:模型组、补肾活血高剂量组(简称“高剂量组”)、补肾活血低剂量组(简称“低剂量组”),尼莫地平对照组(简称“对照组”),每组15只。
根据文献报道,采用双侧颈总动脉结扎,反复脑缺血再灌注的方法制备VD小鼠模型。造模结束后除去死亡小鼠,剩余只数分别为:假手术组12只,模型组9只,高、低剂量组各11只,对照组10只。造模结束后第2天各治疗组分别按体重给药治疗,高、低剂量组分别以14.28g生药/kg·d和7.14g生药/kg·d灌服补肾活血方水煎药液,对照组以15.58 mg/kg·d灌服尼莫地平药液,假手术组、模型组均灌服等剂量的0.5％的羧甲基纤维素钠液,连续治疗14 d。
治疗结束后,各组小鼠采用水迷宫法、跳台法进行行为学实验,然后断头处死小鼠,冰盘上快速取脑,弃去嗅球及小脑,取右侧大脑置于4％多聚甲醛固定,乙醇逐级脱水、透明、浸透、石蜡包埋,切片,0.1％硫堇染色,光学显微镜下观察海马病理形态变化;取左脑组织匀浆,提取上清,采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测脑组织bFGF和BDNF含量,采用RT-PCR法检测bFGF mRNA和BDNF mRNA表达的变化。
数据运用SPSS for Windows13.0统计软件处理,计量资料用均数±标准差(-x±s)表示,统计方法采用单因素方差分析,组间两两比较采用q检验,显著性差异水平以0.05和0.01为标准。
结果:
1.各组小鼠行为学的比较
1.1.各组小鼠水迷宫学习成绩的比较与假手术组比较,模型组游全程时间显著延长,错误次数明显增加,具有统计学差异(P＜0.01);与模型组比较,各治疗组游全程时间显著缩短,错误次数明显减少,有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01);高剂量组和低剂量组与对照组比较,学习成绩有统计学差异(P＜0.05);高剂量组与低剂量组比较,学习成绩无统计学差异(P＞0.05)。
1.2.各组小鼠水迷宫记忆成绩的比较与假手术组比较,模型组游全程时间显著延长,错误次数明显增加,具有统计学差异(P＜0.01)。与模型组比较,各治疗组游全程时间显著缩短,错误次数明显减少,有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01);高剂量组与对照组比较,记忆成绩有统计学差异(P＜0.05);低剂量组与对照组比较,学习成绩无统计学差异(P＞0.05);高剂量组与低剂量组比较,学习成绩无统计学差异(P＞0.05)。
1.3.各组小鼠跳台实验学习成绩的比较与假手术组比较,模型组小鼠的反应时间显著延长,错误次数明显增加,具有统计学差异(P＜0.01);与模型组比较,各治疗组反应时间缩短,错误次数减少,有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01);与对照组比较,高剂量组反应时间缩短,错误次数减少,有统计学差异(P＜0.05);高剂量组与低剂量组比较,反应时间明显缩短,有统计学差异(P＜0.05);低剂量组与对照组比较,无统计学差异(P＞0.05)。
1.4.各组小鼠跳台实验记忆成绩的比较与假手术组比较,模型组小鼠的潜伏时间显著缩短,错误次数明显增加,具有统计学差异(P＜0.01);与模型组比较,各治疗组潜伏时间延长,错误次数减少,有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01);高剂量组与对照组比较,潜伏时间延长,错误次数减少,有统计学差异(P＜0.05);高剂量组与低剂量组比较,错误次数减少,有统计学差异(P＜0.05);低剂量组与对照组比较,无统计学差异(P＞0.05)。
2.各组小鼠海马锥体细胞病理形态学的比较硫堇染色显示,假手术组海马轮廓清楚,CA1区锥体细胞数目多,排列紧密,细胞核圆而大,核仁清晰,胞浆内尼氏体丰富。模型组海马CA1区锥体细胞数目明显减少,排列稀疏,层次减少,胞浆内尼氏体减少或消失,大部分细胞核体积变小、深染,结构不清,呈核固缩表现,有的呈三角形或多角形。高剂量组海马CA1区锥体细胞仅有少量脱失,数目有所减少,排列较为紧密,层次较为清晰,有少数细胞核固缩。低剂量组和对照组小鼠海马CA1区锥体细胞部分脱失,数目减少,排列较稀疏,有部分细胞核固缩为三角形或多角形,低剂量组优于对照组。
3.各组小鼠脑组织bFGF含量的比较与假手术组比较,模型组小鼠脑组织bFGF含量明显升高,二者有统计学差异(P＜0.05)。与模型组比较,各治疗组小鼠脑组织bFGF含量均明显升高,有统计学差异(P＜0.01),高剂量组与对照组比较,bFGF含量明显升高,有统计学差异(P＜0.05),低剂量组与对照组比较,bFGF含量有升高趋势,但无统计学差异(P＞0.05);高剂量组与低剂量组比较,bFGF含量有升高趋势,但无统计学差异(P＞0.05)。
4.各组小鼠脑组织BDNF含量的比较与假手术组比较,模型组小鼠脑组织BDNF含量明显升高,二者有统计学差异(P＜0.01)。与模型组比较,各治疗组小鼠脑组织BDNF含量均明显升高,有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01);高剂量组与对照组比较,BDNF含量明显升高,具有统计学差异(P＜0.01),低剂量组与对照组比较,BDNF含量有升高趋势,但无统计学差异(P＞0.05);高剂量组与低剂量组比较,BDNF含量明显升高,具有统计学差异(P＜0.05)。
5.各组小鼠脑组织bFGF mRNA表达相对含量的比较与假手术组比较,模型组小鼠脑组织bFGF mRNA表达相对含量明显升高,二者有统计学差异(P＜0.01);与模型组比较,各治疗组bFGF mRNA表达相对含量均明显升高,有统计学差异(P＜0.01);高剂量组与对照组比较,bFGF mRNA表达相对含量明显升高,有统计学差异(P＜0.05);低剂量组与对照组比较,bFGF mRNA表达相对含量明显升高,有统计学差异(P＜0.05);高剂量组与低照组比较,bFGF mRNA表达相对含量有升高趋势,但无统计学差异(P＞0.05)。
6.各组小鼠脑组织BDNF mRNA表达相对含量的比较与假手术组比较,模型组小鼠脑组织BDNF mRNA表达相对含量明显升高,二者有统计学差异(P＜0.01);与模型组比较,各治疗组BDNFmRNA表达相对含量均明显升高,有统计学差异(P＜0.01);高剂量组与对照组比较,BDNF mRNA表达相对含量明显升高,有统计学差异(P＜0.01);低剂量组与对照组比较,BDNF mRNA表达相对含量明显升高,有统计学差异(P＜0.05);高剂量组与低照组比较,bFGF mRNA表达相对含量有升高趋势,但无统计学差异(P＞0.05)。
结论:
补肾活血方可改善实验性VD模型小鼠病理形态学,促进学习记忆能力,其治疗VD的机理之一是调节脑组织bFGFmRNA和BDNFmRNA的表达,修复和保护受损的神经元,减轻脑缺血损伤,从而提高学习记忆能力。