前言所有哺乳动物的卵母细胞都存在G2期阻滞，G2期阻滞的卵母细胞有一特征性核结构—生发泡（germinal vesicle），减数分裂恢复后，生发泡破裂（GVBD，germinal vesicle break down），染色体凝集，纺锤体形成，第一极体形成后，立即进行第二次减数分裂，在MII期阻滞直至受精。在减数分裂恢复过程中，MPF（有丝分裂促进因子）的激活是启动卵母细胞减数分裂成熟的核心环节。MPF的催化亚基Cdc2是一种分子量34KD左右的蛋白激酶，它需要与周期蛋白（Cyclin）B结合才能产生活性，在复合物形成后Cdc2主要受磷酸化和去磷酸化作用的调节，由蛋白激酶Wee1或Myt1催化14／Thr（苏氨酸残基）和15／Tyr（酪氨酸残基）磷酸化使其失活。Cdc25蛋白家族是Thr／Tyr双特异性蛋白磷酸酶，能去除14／Thr和15／Tyr的抑制性磷酸化修饰，推动减数分裂进行。Cdc25蛋白的酶活性亦受磷酸化调节，此外，与14-3-3蛋白的相互作用、亚细胞定位也与其磷酸酶活性密切相关。我们实验室已经发现在小鼠卵母细胞中，Cdc25B的321位丝氨酸是抑制性磷酸化位点，将它突变为不能被磷酸化的丝氨酸后，Cdc25B的细胞定位发生改变，酶活性不在受高PKA浓度抑制，应用LMB处理卵母细胞证明Cdc25B蛋白存在由NES介导的核输出。而到目前为止，在小鼠卵母细胞中关于Cdc25B的亚细胞定位机制尚无明确报道。生物信息学提示Cdc25B蛋白存在核输出序列（nuclear export sequence，NES）位于52-65位氨基酸（VTTLTQTMHNLAGL）及核定位序列（nuclear localization sequence，NLS）位于343-350位氨基酸（PVQSKRRK）。通过构建突变体的形式，观察Cdc25B蛋白的定位和功能的关系，探讨Cdc25B蛋白对小鼠卵母细胞减数分裂的调节机制。实验材料与方法1、材料和试剂中国医科大学实验动物部提供昆明系雌性白小鼠；pBSK-Cdc25B-WT由Tony Hunter教授（The Salk Institute）惠赠；pEGFP-C3由复旦大学刘喻博士惠赠；克隆载体pGEM-T vector为Promega公司产品；pBluescriptⅡ／SK及JM109菌株为本室保存；限制性内切酶XhoI、BamHI、XbaI及ExtaqDNA聚合酶（MBI公司）；T4 DNA连接酶、氨卞青霉素（Amp）、卡那霉素（kana）购自Takara公司；DNA快速纯化／回收试剂盒、质粒DNA纯化试剂盒购自Promega公司；mMESSAGE mMACHINE体外转录试剂盒购自Ambion公司；LB培养基购自Gibco公司；丙酮酸钠、牛血清白蛋白（BSA，FractionⅤ）、M₂培养液、矿物油、二丁烯环一磷酸腺苷（dbcAMP）购自Sigma公司；Waymouth MB752／1培养液购自Invitrogen公司Cdc2-Tyr15磷酸化抗体、辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG为Santa产品。2、重组质粒的构建以质粒pBSK-Cdc25B为模板，用特异性引物，进行PCR扩增，产物克隆到pGEM-T载体上，测序后挑选鉴定正确的克隆再亚克隆构建成pBSK-Cdc25B-Δ51和pBSK-Cdc25B-Δ65；应用点突变试剂盒构建突变体pBSK-Cdc25B-S149A和pBSK-Cdc25B-L62A。所有重组质粒经测序证明正确。3、小鼠卵母细胞的采集和培养3～4周龄的昆明种雌性白鼠，腹腔注射5IU孕马血清（PMSG），自由采食与饮水，48h后颈椎脱臼法处死，剖开腹腔取出卵巢，放于含有125μmol／L dbcAMP的M₂培养液中，在体视显微镜下用1ml注射器针头剔除卵巢周围脂肪及结缔组织，刺破大的有腔卵泡，获得含完整生发泡（GV）的裸卵母细胞，置于MB培养液中，上覆矿物油在37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱内培养。4、体外转录pBSK-Cdc25B-WT、pBSK-Cdc25B-S149A、pBSK-Cdc25B-Δ51、pBSK-Cdc25B-Δ65；和pBSK-Cdc25B-L62A分别取1μg，经XbaI酶切线性化后应用于体外转录试剂盒将线性模板体外转录成戴帽mRNA，然后用2U DNaseⅠ于37℃反应15min消化DNA模板，用酚、氯仿抽提纯化mRNA，最后加入氯化锂沉淀mRNA。5、mRNA显微注射mRNA溶于无核酸酶污染的5mmol／LTris和0.5mmol／L乙二胺四乙酸（EDTA，PH7.4）中，稀释成不同浓度，用于显微注射。显微注射应用Eppendorf Transferman显微操作系统，OlympusⅨ-70倒置显微镜，DIC调制相差观察。将GV期卵母细胞移入到含125μmol／L dbcAMP的M₂液滴中，为尽量减少显微注射对卵母细胞的影响，一般注入到卵母细胞胞浆内的样品体积为10 pl（0.01ng），这相当于卵母细体积的5％（卵母细体积以200 pl计）。6、免疫荧光法检测Cdc25B在小鼠卵母细胞中的分布将GV期及GVBD期的小鼠卵母细胞用含1％PVA的PBS缓冲液洗涤3次，4％多聚甲醛（溶解于PBS中）室温固定1h，PBST（PBS中加0.01％Tween20）洗涤3次，而后将细胞置于0.1％Triton X-100（溶解于PBS中）30min。用含5％BSA的PBS封闭细胞1h，再将细胞转入含有Cdc25B兔多克隆抗体（1：50稀释）的PBS中4℃过夜；PBS洗涤三次，每次5min，再将细胞转入二抗（FITC标记羊抗兔IgG，1：50稀释）中，室温下孵育1h，PBS洗涤3次，每次3min，再经碘化乙啶（propidium iodide，10ug／ml溶于PBS中）染色3 min，使DNA染色，荧光显微镜观察照相。7、Western-Blot收集卵母细胞，每组200个，3000 rpm／m离心10 min，弃去上清液，加入20 ul蛋白提取缓冲液，于液氮中反复冻融，置于-20℃备用。电泳前，加入SDS样品缓冲液2.0ul，100℃煮沸5min，12％SDS-PAGE电泳分离蛋白质，然后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用含5％BSA的TBS（PH7.4）将滤膜室温摇动温育1h进行封闭，再将滤膜与Cdc2-Tyr15磷酸化抗体4℃温育过夜，经PBST洗涤后，用羊抗兔的IgG作为二抗，室温温育2h，化学发光法显影成像。8、亚细胞定位观察将pEGFP-Cdc25B-WT、pEGFP-Cdc25B-S149A，pEGFP-Cdc25B-L62A，pEGFP-Cdc25B-Δ51和pEGFP-Cdc25B-Δ65质粒注射入卵母细胞的生发泡中，不同注射组的卵母细胞在MB（含500umol／l dbcAMP）培养液中于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱内培养30h，利用荧光显微镜对细胞进行观察，以488nm激发波长激发标本，记录绿色荧光信号所在细胞内位置，并用计算机软件进行成像处理，最后获得融合蛋白在细胞内的定位信息。9、Cdc25B在原核细胞中表达将Cdc25B和Cdc25B-S321A亚克隆入PGEX-4T2载体中，用PGEX-4T2，PGEX-4T2-Cdc25B和PGEX-4T2-Cdc25B-S321A转化BL21菌株于EB培养基中（含氨苄100mg／ml）30℃，220Rpm摇床培养2h左右，当菌浓度OD₅₅₀为0.5～1.0之间时，加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1.0mM继续培养7h，10，000Rpm，4℃离心10 min，收集菌沉淀，-20℃保存。经SDS-PAGE电泳分离蛋白质，抗兔GST抗体4℃温育过夜，经PBST洗涤后，用羊抗兔的IgG作为二抗，室温温育2h，化学发光法显影成像。实验结果1、Cdc25B的149位丝氨酸对小鼠卵母细胞减数分裂的影响将野生型和突变型（S149A）Cdc25B的mRNA显微注射到GV期卵母细胞中，结果显示Cdc25B能促进卵母细胞成熟，突变体丧失对减数分裂的诱导功能。免疫荧光定位分析结果显示，GV期卵母细胞中Cdc25B分布于细胞浆，G2／M转换期存在蛋白的核累积；显微注射融合质粒结果显示，pEGFP-Cdc25B-S149A出现核滞留。2、小鼠卵母细胞中Cdc25B的NES序列的确证将Cdc25B-Δ51和Cdc25B-Δ65的mRNA显微注射到GV期卵母细胞中，结果显示两种突变体丧失对减数分裂的诱导功能；显微注射融合质粒结果显示，pEGFP-Cdc25B-Δ51的荧光信号曾核浆分布，pEGFP-Cdc25B-Δ65的荧光信号分布在细胞核中提示52-65位氨基酸序列影响蛋白的核输出。对NES关键氨基酸的突变研究显示，Cdc25B-L62A丧失对减数分裂的诱导功能，其融合质粒的绿色荧光信号也分布在细胞核中，进一步确证52-65位氨基酸序列具有核输出功能。3、Cdc25B蛋白的原核表达经Western-Blot，结果显示原核表达出分子量27KD的GST标签蛋白和60KD左右的融合蛋白。讨论MPF的激活是启动细胞进入有丝分裂的核心。CDC25蛋白对MPF（CDC2／CyclinB）激活有重要作用。G2／M转换期CDC25蛋白活化，使CDC2的14-Thr和15-Tyr位点发生去磷酸化，MPF被激活，促进G2／M转换。CDC25蛋白家族包括三种同分体：CDC25A，Cdc25B，CDC25C，三种磷酸酶在氨基端有50％的同源性，羧基端高度同源，氨基端的区域差异提示三种磷酸酶在细胞周期的调控中发挥不同的功能。Cdc25B被认为是有丝分裂的启动子，CDC25 A和CDC25C不能替代Cdc25B诱导的G2／M转换。哺乳动物的卵母细胞阻滞在G2期，减数分裂的重启动同样需要活化的MPF，野生型Cdc25B能以剂量依赖方式促进卵母细胞成熟，但是其在减数分裂过程中发挥功能的具体调节机制仍不清楚。本研究以小鼠卵母细胞为对象，通过构建突变体的方式，对Cdc25B蛋白在减数分裂启动中的作用机制进行了初步探讨，在人类，Cdc2581是在胞核中活化周期蛋白，启动有丝分裂，146位丝氨酸（对应于小鼠的149位氨基酸）突变后，蛋白在细胞中的定位发生改变，诱导有丝分裂的能力丧失。核定位序列（nuclear localization sequence，NLS）突变后，Cdc2581几乎完全滞留在细胞浆中，不能诱导有丝分裂，即Cdc2581的胞浆累积不能够有效的启动有丝分裂，提示蛋白的功能与定位密切相关。应用免疫组化和显微注射的方法证实，在小鼠卵母细胞发生减数分裂的过程中，Cdc25B蛋白有核聚集发生，这提示确实存在蛋白质动态核浆穿梭，减数分裂的恢复需要蛋白质入核以加强其减数分裂的诱导作用。而149位氨基酸突变为不能被磷酸化的丙氨酸后，Cdc25B蛋白在卵母细胞中的定位发生改变，出现核滞留提示该氨基酸的突变可能通过某种机制影响了蛋白质的核浆穿梭。149位丝氨酸与NES相邻近，为此，我们推断149位丝氨酸磷酸化后使NES暴露或是发生构象改变使Cdc25B蛋白保持核浆穿梭动态平衡；突变体则使NES的功能受到抑制而使入核速率大于出核速率发生核滞留。在小鼠卵母细胞中，Cdc25B蛋白存在核输出序列和核定位序列参与的核浆穿梭，Cdc25B需定位于细胞核中才能发挥作用，而其在核中定位需要完整的149位丝氨酸参与。既然149位丝氨酸的突变即改变了蛋白的亚细胞定位，又使蛋白丧失了诱导减数分裂的诱导功能。这促使我们想进一步明确Cdc25B蛋白是否存在某些结构域与该蛋白的卵母细胞内的定位有关，为此，我们构建了突变体Cdc25B-Δ51和Cdc25B-Δ65，通过mRNA注射观察到二者均使Cdc25B丧失了减数分裂的诱导功能。尽管试验结果再一次证明Cdc25B的N末端的氨基酸序列对减数分裂的恢复起促进作用，但尚不能提供该序列确有诱导蛋白出核的信息。于是，我们构建了pEGFP-Cdc25B-Δ51和pEGFP-Cdc25B-Δ65融合质粒，通过观测EGFP产生的荧光观察外源蛋白质在细胞内的表达、迁移及定位情况，结果表明Cdc25B蛋白在卵母细胞中确实存在核浆穿梭，pEGFP-Cdc25B-Δ65发出的荧光信号主要位于核中，说明缺失65个氨基酸的蛋白已经不包含NES序列而不能出核；pEGFP-Cdc25B-Δ51发出的荧光信号在胞核及胞浆中均有分布，提示该Cdc25B突变体尚包含有核输出序列及核定位序列，存在核输出及核输入，但由于缺失N末端51个氨基酸而功能受损，致使入核速率增加，出核速率减慢而出现核滞留。为进一步确认NES序列，我们构建了62位亮氨酸（一个高度保守的氨基酸位点）突变体PBSK-Cdc25B-L62A和pEGFP-Cdc25B-L62A，观察突变体对卵母细胞成熟的影响及其在卵母细胞中的定位，结果显示，突变体丧失了对卵母细胞减数分裂的诱导作用，定位分析发现突变蛋白分布于细胞核中，这进一步支持了52-65位的氨基酸确有诱导Cdc25B出核的功能。Cdc25B是在细胞浆中活化CDC2／cyclinB，恢复减数分裂，Cdc25B的亚细胞定位同它是否能正常发挥生物学功能密切相关。综上，我们首次在小鼠卵母细胞中研究了149位丝氨酸可能是通过作用Cdc25B蛋白的NES，改变了蛋白的核输出速度，使Cdc25B蛋白的核浆穿梭平衡破坏而影响蛋白功能和定位。由此，我们设计实验，首次在小鼠卵母细胞中确证NES的具体位置，通过关键氨基酸的突变进一步验证了这是一段有功能的核输出序列。本研究通过对Cdc25B蛋白质序列与小鼠卵母细胞减数分裂恢复间的关系的初步分析，并探讨了其受调控的可能机制，为其它哺乳动物的卵母细胞的成熟调控和生殖疾病的机理研究奠定了一定的基础。1、149位丝氨酸是Cdc25B蛋白诱导小鼠卵母细胞减数分裂恢复和蛋白质正常的亚细胞定位所必需的。2、小鼠卵母细胞Cdc25B蛋白质的N端52-65位氨基酸之间存在一有功能的核输出序列，与蛋白质的生理功能密切相关。