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固醇调节元件结合蛋白-1(Sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)是哺乳动物体内重要的核转录因子之一,主要参与调控内源的胆固醇、脂肪酸、磷脂及甘油三酯等的生物合成及代谢。在反刍动物乳腺组织中,SREBP-1通过激活乳脂合成及分泌过程中关键基因及酶的表达,促进脂肪酸的从头合成过程,调控乳中有益脂肪酸的成分及含量,是乳脂合成的关键调控因子。羊奶含有丰富的短中链脂肪酸(C≤16),因此,通过奶山羊SREBP-1基因的功能研究解析乳腺上皮细胞脂肪酸代谢调控作用,对奶山羊育种及羊奶成分调控具有重要理论意义和实际应用价值。本研究通过腺病毒介导的超表达技术及si RNA介导的干扰技术对SREBP-1基因的基本功能进行探讨,并使用LXR-SREBP1通路的激动剂(T0901317)进行功能验证;通过对山羊SREBP-1c及ACSS2基因启动子的克隆及突变研究,探讨山羊SREBP-1c基因及ACSS2基因的转录调控机制;通过对脂肪酸从头合成过程中关键酶ACSS2及ACLY基因的干扰研究,验证其对脂肪酸从头合成及甘油三酯合成的影响。本研究的主要结果如下:1.山羊SREBP-1基因的过表达研究将克隆得到的山羊SREBP-1基因(1-1 209 bp,n SREBP1)构建到p Adtrack-CMV穿梭载体中,与骨架载体p Ad Easy-1重组后,转染HEK293细胞,包装扩增出高滴度的重组腺病毒Ad-n SREBP1,感染山羊原代乳腺上皮细胞48 h后,SREBP-1基因m RNA水平及蛋白水平显著上调,同时导致脂肪酸合成代谢相关基因:ACSL1,FABP3,ELOVL6,SCD1,ACSS2,ACLY,ACACA,FASN,IDH1,INSIG1,NR1H3,PPARG等基因的表达量显著上调(P<0.05),而SREBP-1蛋白成熟裂解过程的护送蛋白SCAP的表达量则显著下调(P<0.05)。同时,过表达SREBP-1基因显著上调甘油三酯合成相关基因LPIN1、DGAT1的表达量及细胞内甘油三酯的含量(P<0.01),细胞内C16:0及C18:1的含量显著增加(P<0.05),C16:1,C18:0及C18:2的含量显著减少(P<0.05),而细胞内长链多不饱和脂肪酸(如C20:4及C22:6)的含量无明显变化(P>0.05)。2.山羊SREBP-1基因的RNA干扰设计并合成特异靶向SREBP-1基因氨基末端活性区域的si RNA,稀释后转染山羊原代乳腺上皮细胞,48 h后,SREBF1及SREBP-1a基因表达量显著下调60%以上(P<0.01),SREBP1蛋白成熟形式表达量显著减少。SREBP1基因的干扰导致细胞内脂肪酸合成、转运相关基因及脂代谢调控因子(SCD1,ELOVL6,ACLY,ACSS2,IDH1,FABP3,ACSL1,SLC27A6,INSIG1,SCAP,PPARG及CPT1A)的表达量显著下调(P<0.05),PLIN3,XDH,PPARA及ACOX的表达量显著上调(P<0.05),ACACA,FASN,CD36,GPAM,DGAT1,PLIN2,NR1H3,ATGL,HSL等基因的表达量无显著变化(P>0.05)。SREBP1基因的干扰导致细胞内甘油三酯的含量显著下调(P<0.05),细胞内胆固醇的含量下调。3.LXRα-SREBP1通路激活对山羊乳腺脂肪酸代谢的影响使用不同浓度LXRα特异性激动剂T0901317处理山羊乳腺上皮细胞48 h后,SREBP1基因转录水平及蛋白水平的表达量均呈梯度上升趋势,并且细胞核内成熟形式的SREBP-1蛋白积累增加。同时,T0901317的添加激活细胞内长链脂肪酸激活、转运、去饱和,脂肪酸从头合成,及甘油三酯合成等生理过程,导致SCL27A6,ACSL1,FABP3,SCD1,ELOVL6,ACSS2,ACLY,ACACA,FASN,IDH1,GPAM,LPIN1,DGAT1,DGAT2,PLIN2,PLIN3,ATGL,XDH等基因的表达量显著上调(P<0.05),同时脂代谢调控因子INSIG1,SCAP,PPARA及PPARG的表达量也显著上调(P<0.05)。LXRα-SREBP1通路的激活导致细胞内脂滴数量及甘油三酯含量均显著增加,细胞内C16:0及C18:2含量降低,C18:0的含量显著减少(P<0.05),单不饱和脂肪酸(C16:1,C18:1,C20:1及C22:1)的含量显著增加(P<0.05),长链多不饱和脂肪酸的含量显著降低(P<0.01)。4.山羊SREBP-1c基因的转录调控作用克隆得到山羊SREBP-1c基因5’侧翼序列2 186 bp,含转录起始位点上游2 012 bp。生物信息学分析发现,SREBP-1c启动子序列含有两个SREBP1结合位点(SRE),两个LXR结合位点(LXRE),并且在两个SRE位点附近含有核因子Y结合位点(NF-Y)及Sp1位点。荧光素酶活性分析表明,LXR的激动剂T0901317可以显著上调SREBP-1c的启动子活性(P<0.05),而SREBP1基因的si RNA导致SREBP-1c启动子活性显著下调(P<0.01)。缺失突变结果表明,SREBP-1c基因启动子核心区域位于-395 bp~+1 bp;并且,当SREBP-1c启动子由-395 bp缺失到-86 bp时,T0901317对SREBP-1c基因启动子的激活作用消失。定点突变SRE及LXRE位点后转染山羊原代乳腺上皮细胞,结果表明:两个SRE位点的单突变或者双突变均导致SREBP-1c启动子基础活性显著下调(P<0.01),而LXRE位点的突变对启动子活性无明显下调作用(P>0.05)。使用T0901317处理后,单一位点的LXRE或者SRE位点的突变均导致T0901317对SREBP-1c启动子的激活作用减弱,而两个LXRE位点的同时突变则导致T0901317对SREBP-1c启动子的激活作用消失。结果表明,LXRα及n SREBP1均对山羊SREBP-1c基因的表达有重要的调控作用。5.山羊ACSS2基因的转录调控作用扩增得到山羊ACSS2基因启动子5’侧翼序列2 359 bp,含转录起始位点上游1 976 bp。启动子序列分析结果表明,ACSS2启动子上存在SREBP-1,LXR,NF-Y,Sp1和STAT5等转录因子结合位点。启动子荧光素酶活性分析发现,SREBP1基因的si RNA显著下调ACSS2基因启动子活性(P<0.05),而LXR的特异性激动剂T0901317导致ACSS2基因启动子活性显著升高(P<0.05)。缺失突变发现,ACSS2基因启动子核心区域位于-515 bp~+1 bp,并且在该区域内存在一个保守的SRE位点。对SRE位点进行定点突变后,导致ACSS2启动子活性显著下调(P<0.05)。染色质免疫共沉淀实验结果表明,SREBP1蛋白与ACSS2启动子上的SRE元件序列结合,直接调控ACSS2基因的表达。6.ACSS2及ACLY共同干扰对脂肪酸及甘油三酯合成的影响设计并合成特异靶向山羊ACSS2及ACLY基因的si RNA,转染山羊原代乳腺上皮细胞48 h后,ACSS2及ACLY基因m RNA表达量显著下调70%左右(P<0.05),同时,细胞内脂代谢相关基因ACACA,FASN,SCD1,ELOVL6,DGAT1,DGAT2,AGPAT6,FABP3,CD36,PPARA,ACOX,CPT1A,PLIN2,PLIN3等基因的表达量显著下调(P<0.05),细胞内脂滴积累减少,甘油三酯含量降低。综上所述,SREBP1基因广泛参与调控脂肪酸生物合成、转运及甘油三酯合成等生物过程中相关基因的表达,增加细胞内单不饱和脂肪酸的含量,降低长链多不饱和脂肪酸的含量。LXRα基因可直接激活SREBP-1基因的表达,共同调控山羊乳腺脂肪酸代谢,并且山羊SREBP-1c基因同时受到LXRα及其成熟形式n SREBP1的调控。SREBP-1基因可在转录水平直接调控ACSS2基因的表达,影响脂肪酸及甘油三酯的合成。