SREBP-1基因对山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的调控作用研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jjkjlhj
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
固醇调节元件结合蛋白-1(Sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)是哺乳动物体内重要的核转录因子之一,主要参与调控内源的胆固醇、脂肪酸、磷脂及甘油三酯等的生物合成及代谢。在反刍动物乳腺组织中,SREBP-1通过激活乳脂合成及分泌过程中关键基因及酶的表达,促进脂肪酸的从头合成过程,调控乳中有益脂肪酸的成分及含量,是乳脂合成的关键调控因子。羊奶含有丰富的短中链脂肪酸(C≤16),因此,通过奶山羊SREBP-1基因的功能研究解析乳腺上皮细胞脂肪酸代谢调控作用,对奶山羊育种及羊奶成分调控具有重要理论意义和实际应用价值。本研究通过腺病毒介导的超表达技术及si RNA介导的干扰技术对SREBP-1基因的基本功能进行探讨,并使用LXR-SREBP1通路的激动剂(T0901317)进行功能验证;通过对山羊SREBP-1c及ACSS2基因启动子的克隆及突变研究,探讨山羊SREBP-1c基因及ACSS2基因的转录调控机制;通过对脂肪酸从头合成过程中关键酶ACSS2及ACLY基因的干扰研究,验证其对脂肪酸从头合成及甘油三酯合成的影响。本研究的主要结果如下:1.山羊SREBP-1基因的过表达研究将克隆得到的山羊SREBP-1基因(1-1 209 bp,n SREBP1)构建到p Adtrack-CMV穿梭载体中,与骨架载体p Ad Easy-1重组后,转染HEK293细胞,包装扩增出高滴度的重组腺病毒Ad-n SREBP1,感染山羊原代乳腺上皮细胞48 h后,SREBP-1基因m RNA水平及蛋白水平显著上调,同时导致脂肪酸合成代谢相关基因:ACSL1,FABP3,ELOVL6,SCD1,ACSS2,ACLY,ACACA,FASN,IDH1,INSIG1,NR1H3,PPARG等基因的表达量显著上调(P<0.05),而SREBP-1蛋白成熟裂解过程的护送蛋白SCAP的表达量则显著下调(P<0.05)。同时,过表达SREBP-1基因显著上调甘油三酯合成相关基因LPIN1、DGAT1的表达量及细胞内甘油三酯的含量(P<0.01),细胞内C16:0及C18:1的含量显著增加(P<0.05),C16:1,C18:0及C18:2的含量显著减少(P<0.05),而细胞内长链多不饱和脂肪酸(如C20:4及C22:6)的含量无明显变化(P>0.05)。2.山羊SREBP-1基因的RNA干扰设计并合成特异靶向SREBP-1基因氨基末端活性区域的si RNA,稀释后转染山羊原代乳腺上皮细胞,48 h后,SREBF1及SREBP-1a基因表达量显著下调60%以上(P<0.01),SREBP1蛋白成熟形式表达量显著减少。SREBP1基因的干扰导致细胞内脂肪酸合成、转运相关基因及脂代谢调控因子(SCD1,ELOVL6,ACLY,ACSS2,IDH1,FABP3,ACSL1,SLC27A6,INSIG1,SCAP,PPARG及CPT1A)的表达量显著下调(P<0.05),PLIN3,XDH,PPARA及ACOX的表达量显著上调(P<0.05),ACACA,FASN,CD36,GPAM,DGAT1,PLIN2,NR1H3,ATGL,HSL等基因的表达量无显著变化(P>0.05)。SREBP1基因的干扰导致细胞内甘油三酯的含量显著下调(P<0.05),细胞内胆固醇的含量下调。3.LXRα-SREBP1通路激活对山羊乳腺脂肪酸代谢的影响使用不同浓度LXRα特异性激动剂T0901317处理山羊乳腺上皮细胞48 h后,SREBP1基因转录水平及蛋白水平的表达量均呈梯度上升趋势,并且细胞核内成熟形式的SREBP-1蛋白积累增加。同时,T0901317的添加激活细胞内长链脂肪酸激活、转运、去饱和,脂肪酸从头合成,及甘油三酯合成等生理过程,导致SCL27A6,ACSL1,FABP3,SCD1,ELOVL6,ACSS2,ACLY,ACACA,FASN,IDH1,GPAM,LPIN1,DGAT1,DGAT2,PLIN2,PLIN3,ATGL,XDH等基因的表达量显著上调(P<0.05),同时脂代谢调控因子INSIG1,SCAP,PPARA及PPARG的表达量也显著上调(P<0.05)。LXRα-SREBP1通路的激活导致细胞内脂滴数量及甘油三酯含量均显著增加,细胞内C16:0及C18:2含量降低,C18:0的含量显著减少(P<0.05),单不饱和脂肪酸(C16:1,C18:1,C20:1及C22:1)的含量显著增加(P<0.05),长链多不饱和脂肪酸的含量显著降低(P<0.01)。4.山羊SREBP-1c基因的转录调控作用克隆得到山羊SREBP-1c基因5’侧翼序列2 186 bp,含转录起始位点上游2 012 bp。生物信息学分析发现,SREBP-1c启动子序列含有两个SREBP1结合位点(SRE),两个LXR结合位点(LXRE),并且在两个SRE位点附近含有核因子Y结合位点(NF-Y)及Sp1位点。荧光素酶活性分析表明,LXR的激动剂T0901317可以显著上调SREBP-1c的启动子活性(P<0.05),而SREBP1基因的si RNA导致SREBP-1c启动子活性显著下调(P<0.01)。缺失突变结果表明,SREBP-1c基因启动子核心区域位于-395 bp~+1 bp;并且,当SREBP-1c启动子由-395 bp缺失到-86 bp时,T0901317对SREBP-1c基因启动子的激活作用消失。定点突变SRE及LXRE位点后转染山羊原代乳腺上皮细胞,结果表明:两个SRE位点的单突变或者双突变均导致SREBP-1c启动子基础活性显著下调(P<0.01),而LXRE位点的突变对启动子活性无明显下调作用(P>0.05)。使用T0901317处理后,单一位点的LXRE或者SRE位点的突变均导致T0901317对SREBP-1c启动子的激活作用减弱,而两个LXRE位点的同时突变则导致T0901317对SREBP-1c启动子的激活作用消失。结果表明,LXRα及n SREBP1均对山羊SREBP-1c基因的表达有重要的调控作用。5.山羊ACSS2基因的转录调控作用扩增得到山羊ACSS2基因启动子5’侧翼序列2 359 bp,含转录起始位点上游1 976 bp。启动子序列分析结果表明,ACSS2启动子上存在SREBP-1,LXR,NF-Y,Sp1和STAT5等转录因子结合位点。启动子荧光素酶活性分析发现,SREBP1基因的si RNA显著下调ACSS2基因启动子活性(P<0.05),而LXR的特异性激动剂T0901317导致ACSS2基因启动子活性显著升高(P<0.05)。缺失突变发现,ACSS2基因启动子核心区域位于-515 bp~+1 bp,并且在该区域内存在一个保守的SRE位点。对SRE位点进行定点突变后,导致ACSS2启动子活性显著下调(P<0.05)。染色质免疫共沉淀实验结果表明,SREBP1蛋白与ACSS2启动子上的SRE元件序列结合,直接调控ACSS2基因的表达。6.ACSS2及ACLY共同干扰对脂肪酸及甘油三酯合成的影响设计并合成特异靶向山羊ACSS2及ACLY基因的si RNA,转染山羊原代乳腺上皮细胞48 h后,ACSS2及ACLY基因m RNA表达量显著下调70%左右(P<0.05),同时,细胞内脂代谢相关基因ACACA,FASN,SCD1,ELOVL6,DGAT1,DGAT2,AGPAT6,FABP3,CD36,PPARA,ACOX,CPT1A,PLIN2,PLIN3等基因的表达量显著下调(P<0.05),细胞内脂滴积累减少,甘油三酯含量降低。综上所述,SREBP1基因广泛参与调控脂肪酸生物合成、转运及甘油三酯合成等生物过程中相关基因的表达,增加细胞内单不饱和脂肪酸的含量,降低长链多不饱和脂肪酸的含量。LXRα基因可直接激活SREBP-1基因的表达,共同调控山羊乳腺脂肪酸代谢,并且山羊SREBP-1c基因同时受到LXRα及其成熟形式n SREBP1的调控。SREBP-1基因可在转录水平直接调控ACSS2基因的表达,影响脂肪酸及甘油三酯的合成。
其他文献
随着时间的推进,巴基斯坦K2、K3项目、福建福清5、6号核电站项目工程工作已经进入了如火如荼的阶段。在工程量文件编制过程中出现了编制细则不统一、覆盖不全,工程量计算偏差
以物流企业XN物流为案例探索目前我国物流企业的创新成长路径状况,以灰色经济计量模型为基础,选择能够体现XN物流成长性以及技术创新、市场创新和管理创新的指标,实证检验目
压缩货车在企业专用线停时,一方面可督促企业提高货车作业效率,增加货车利用率,另一方面可减少货车延期占用费,降低企业生产成本。本文以西安局西平线小庄专用线为例,分析影
目的:慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种常见的恶性血液病,90%以上的CML患者体内存在特征性染色体异常,即费城染色体阳性(ph~+),形成bcr/abl融合基因,转
城市交通的重要性、系统复杂性以及传统信号配时方法固有的局限性使得信号配时系统面临杌理变革与更新的挑战。在已有理论成果的基础上,将多智能体这一新的概念应用于信号配时
微表处施工过程中经常出现表现不均匀、光板路、接缝不美观、表面划痕、泛油、脱落掉粒等质量问题,每一类问题都有相应的解决办法来实现质量控制。
为了满足固定污染源在线分析仪器比对和现场环境监督检查的需要,研制了一种基于傅里叶红外光谱分析技术的便携式气体分析仪,从硬件与软件两方面详细描述了该分析仪的功能特点
随着5G通信网络应用的不断发展,如何有效的在特殊的空间对通信信号进行覆盖建设,成为人们关注的重点问题,利用电缆可以有效的解决5G信号的覆盖问题。通过对5G通信电缆的特征
灾害可以是自然的,也可以是人为的,它严重威胁人们的健康和安全,能够改变社区环境、冲击物质资源,影响着人们的健康生活和社会的发展。在突发事件发生后,基层医务人员的急救