草甘膦诱导PC12细胞死亡的初步分子机制研究

来源 :上海交通大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yuanjinxing1987
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目的:草甘膦(Glyphosate)作为一种有机磷除草剂,广泛应用于农田作业。有关草甘膦吸入和经皮肤引起的急性中毒多见报道,但关于其引起神经系统疾病,尤其是神经变性疾病,如帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的报道极少。据现有资料分析,草甘膦有可能是通过影响线粒体呼吸链,引起自噬的变化,从而导致神经系统的选择性变性。本研究旨在探讨草甘膦刺激下多巴胺能PC12细胞活力变化和细胞死亡方式,以及自噬和凋亡在其中的可能角色,并进一步研究其成为PD相关神经毒素的可能性,为进一步探讨PD的发病机制奠定基础。  方法:采用噻唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)方法检测草甘膦处理后的多巴胺能PC12细胞活力以及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)处理后的多巴胺能 PC12细胞活力;采用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色检测草甘膦处理后的多巴胺能PC12细胞凋亡形态学改变,采用流式细胞术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)检测草甘膦及自噬抑制3-MA处理后的多巴胺能PC12细胞死亡方式。采用免疫荧光方法检测草甘膦处理后的多巴胺能PC12细胞内自噬标志LC3蛋白分布的变化,采用Western Blot检测草甘膦处理后的多巴胺能PC12细胞内自噬标志LC3蛋白表达量的变化。  结果:1、多巴胺能PC12细胞经10mM草甘膦溶液处理24h后,MTT法检测到细胞活力的明显下降,40mM的草甘膦溶液24h处理可以使细胞活力下降到60%左右,加入自噬抑制剂后可以观察到细胞活力的上升。2、DAPI染色可见40mM的草甘膦溶液24h处理的细胞核形态的变化,提示有凋亡的产生。3、FACS结果显示,草甘膦可引起多巴胺能PC12细胞的凋亡,自噬抑制剂可以减少多巴胺能PC12细胞凋亡的数量。4、免疫荧光结果显示,草甘膦处理后的多巴胺能PC12细胞中LC3产生了点状聚集,提示有自噬的发生。5、Western Blot结果显示草甘膦处理后的多巴胺能PC12细胞中LC3-I含量减少,LC3-II含量增多,表示有自噬的发生。  结论:草甘膦处理多巴胺能PC12细胞通过但不仅限于自噬与凋亡途径导致细胞活力下降。
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