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研究背景和目的颅骨锁骨发育不良综合征(Cleidocranial dysplasia,CCD)是一种罕见的常染色体显性遗传性疾病(OMIM:119600),发病率约为1/1,000,000,性别和年龄无差异。CCD最典型的临床特征是囟门闭合迟缓或不闭合;锁骨发育不全;乳牙滞留、埋伏牙和多生牙。成骨细胞特异性转录因子(Runt-related transcription factor 2,RU X2)被确定为CCD的致病基因。该基因在成骨细胞的分化和软骨细胞的成熟过程中发挥着重要的作用。目前,对于CCD的诊断和治疗是临床工作的难点;利用分子生物学和生物信息学等技术深入探讨CCD的发病机制是研究工作的热点。近年来尽管CCD患者的RUNX2基因突变位点陆续被报道,但是此疾病致病基因筛选工作还远远不够。本研究通过对一个CCD家系患者的颅颌面特征进行分析,为临床对该疾病的诊断提供帮助,;并对该家系进行RUNX2基因突变位点的筛查以及体外功能性研究,在分子和蛋白水平进一步探讨CCD患者的发病机制,为遗传咨询和基因诊断的开展打下基础。材料与方法1.以一个中国广州的CCD家系成员为研究对象,对患病成员进行病史采集和记录(包括口腔和大体检查以及影像学检查),并分析患者颅面部软硬组织特征。2.采用酚/氯仿法提取家系成员外周血DNA,通过Sanger测序技术以及家系共分离等方法,确定致病基因与突变位点。3.使用高分辨率熔炼曲线(High Resolution Melting,HRM)技术筛查当地人群200份随机样本,确定RUNX2基因突变位点的突变频率。4.采用Trizol法提取外周血细胞总RNA,利用qRT-PCR来检测家系中正常人与患者外周血中RUNX2基因转录水平的差异。5.使用结构预测软件SOPMA和I-TASSER分别预测RUNX2突变蛋白的二级蛋白结构和三维构象。6.将人类RUNX2基因正常转录本与异常转录本的cDNA克隆到载体pEGFP-C1上,利用lipo2000转染到HEK-293T细胞中后提取细胞的总RNA和总蛋白,采用qRT-PCR和Western Blot技术分别检测野生型和突变型重组载体转染到HEK-293T细胞后RUNX2mRNA和其蛋白表达水平的差异。7.利用上一步中已转染好的HEK-293T细胞,用DAPI染核技术染核,于共聚焦显微镜下观察拍照,比较野生型与突变型融合蛋白在细胞中表达部位的差异。结果1.该CCD家系患者临床特征先证者表现出典型的CCD特征,包括口腔异常(乳牙滞留、大量埋伏牙和多生牙)和锁骨发育不良。颌面部也表现出特征性改变,表现为眼距增宽,鼻梁塌陷,面中部发育不足;头影测量分析表明上颌骨发育不足,下颌前突。先证者胞姐表现出类似的颌面部特征。2.确定突变位点Sanger测序结果显示该家系患病成员RUNX2基因编码区的第1271位碱基C发生了缺失(c.1271delC),该突变位点位于7号外显子编码的核基质定位信号区(NMTS,subnuclear matrix targeting signal),突变最终引起了39个氨基酸的缺失。在该家系正常成员以及当地200份随机外周血样本中均未发现该位点突变。3.体内mRNA水平分析qRT-PCR检测结果显示在患者和该家系健康人的外周血中RUNX2基因mRNA的表达水平没有明显的差异。4.生物信息学预测分析蛋白二级结构预测结果显示突变蛋白丢失了部分β转角、β折叠和无规则卷曲结构而增加了 α螺旋结构。I-TASSER综合建模法预测结果显示碱基缺失突变体c.1271delC,其蛋白质的三级结构发生明显改变。5.体外mRNA和蛋白表达水平分析qRT-PCR检测结果显示野生型与突变型重组载体转染到HEK-293T细胞后RUNX2基因mRNA相对表达量没有明显的差异;Western blot结果显示突变型RUNX2融合蛋白表达水平高于野生型融合蛋白(p<0.001)。6.亚细胞定位功能亚细胞定位结果显示野生型RUNX2融合蛋白仅在胞核中表达;而突变型RUNX2融合蛋白中在胞浆、胞核内均可见绿色荧光。结论1.本实验中先证者表现出CCD典型的口腔异常(乳牙滞留、埋伏牙和多生牙)和锁骨发育不良,颌面部也具有特征性的改变,包括眼距增宽、面中部发育不足以及下颌前突等。2.本实验在一个CCD家系患者的RUNX2基因上发现了一个新的移码突变c.1271delC,并且在该家系健康成员以及200个随机样本中均未发现该突变位点。3.新的突变点提前产生了新的终止密码子,使RUNX2蛋白发生截短、蛋白质的二级结构和三维构象均发生明显改变。4.碱基缺失突变体c.1271 delC使RUNX2蛋白丢失了转录抑制区和部分NMTS区,使突变蛋白的表达量明显上升,并改变了转录因子仅在细胞核中表达的特性。