无冗余氨基酸鹅α干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物学活性研究

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:lulufii
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干扰素(Interferon, IFN)是由病毒或其它干扰素诱生剂刺激机体易感细胞(巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞等)产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子。在众多干扰素类型中,α-干扰素的广谱抗病毒能力最为显著。毕赤酵母表达系统是目前应用较广的外源蛋白真核表达系统之一,目前,利用该系统已成功表达了哺乳动物、禽类、鱼类等动物干扰素。酵母培养基成分确定,无热原或毒素,不易污染,成本较低,更适宜于规模生产蛋白,因此,利用毕赤酵母表达系统规模化生产有生物学活性的干扰素具有广阔的应用前景。为了获得具抗病毒活性无冗余氨基酸的鹅α干扰素(GoIFN-α),在鹅肝脏组织中克隆获得GoIFN-α基因,克隆核苷酸序列与GenBank上序号为AY524422GoIFN-α核苷酸序列比较,同源性为100%。通过融合PCR的方法将GoIFN-α的N端准确连接入pPICZαA载体的分泌信号肽序列后,构建重组酵母表达质粒pPICZαA-GoIFN-α;重组质粒经SacⅠ线性化后,用LiCl转化法及电转化法转化入酵母菌GS115和X33中。甲醇诱导阳性重组菌96h后,检测筛选最佳表达时间和甲醇浓度。诱导后菌液上清进行盐析处理后进行SDS-PAGE分析,表达的蛋白为一条大小在25~35ku范围内弥散的表达带且较理论值(18ku)大。用以大肠杆菌表达的GoIFN-α为抗原制备的多抗血清进行Western blot检测,证实表达的蛋白为GoIFN-α。经免疫酶斑点技术比较,确定7号重组酵母蛋白的表达量最高。为提高重组GoIFN-α蛋白的表达量,选择7号重组酵母进行发高密度发酵罐培养,并对发酵过程中的溶氧值、流加甲醇量进行控制。发酵后菌液上清进行盐析处理,进行SDS-PAGE分析,显示高密度发酵重组酵母同样获得一条大小在25~35ku范围内弥散的蛋白表达带。利用微量细胞病变抑制法评价了表达的重组鹅GoIFN-α的抗病毒活性。检测摇瓶发酵重组酵母表达的GoIFN-α在DEF上抑制GPMV及VSV的活性分别为1.80×10~5U/mg和2.12×10~5U/mg;高密度发酵重组酵母表达的GoIFN-α在DEF上抑制GPMV及VSV的抗病毒活性分别为2.7×10~5U/mg和4.21×10~5U/mg。
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