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目的： 1.构建并鉴定 PIRES2-EGFP-eIF4E3(野生型，简称 eIF4E3)、PIRES2-EGFP-eIF4E3C69a（突变体，简称 eIF4E3C69a）、PIRES2-EGFP-eIF4E3w86a（突变体，简称eIF4E3 w86a）真核过表达载体。 2.建立eIF4E3野生型和突变体稳定转染宫颈癌细胞株【Hela（HPV18+）细胞株和C33a（HPV-）细胞株】，明确其内源性和外源性eIF4E3基因及突变体的mRNA和蛋白的表达情况。 3.探讨转染eIF4E3野生型和突变体质粒对宫颈癌细胞株增殖、克隆形成率、细胞周期、凋亡、侵袭能力的影响。 方法： 1.通过PCR在人细胞cDNA库中扩增eIF4E3全基因，人工化学合成突变体eIF4E3C69a和eIF4E3w86a。将目的片段和空载质粒PIRES2-EGFP分别进行双酶切后进行连接，重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，摇菌扩增，提取质粒，利用双酶切跑胶、菌液及质粒PCR、DNA测序等进行鉴定。 2.对宫颈癌细胞株 Hela和 C33A瞬时转染 eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3w86a表达质粒，24小时后，用G418药物筛选阳性克隆细胞，qRT-PCR、WesternBlot检测内源性、外源性eIF4E3和突变体在宫颈癌细胞中mRNA和蛋白的情况。 3.采用CCK-8、平板克隆、流式细胞术、Transwell小室等技术分别检测eIF4E3野生型和突变体宫颈癌细胞株的增殖、克隆形成能力、细胞周期、凋亡及侵袭能力的情况。 结果： 1.成功构建eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3w86a真核表达载体 重组质粒双酶切、质粒及菌液PCR结果显示插入片段大小正确，测序结果通过Blast比对NIH基因库的eIF4E3基因序列显示eIF4E3、 eIF4E3C69a、eIF4E3w86a序列准确且编码框架正确插入PIRES2-EGFP中。 2.稳定转染eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3w86a真核表达载体的宫颈癌细胞株的内源性、外源性野生型eIF4E3和突变体eIF4E3的 mRNA和蛋白的表达情况 （1）RT-qPCR结果：内源性eIF4E3 mRNA在Hela和C33A宫颈癌细胞中呈低水平表达；与空载组相比，转染eIF4E3、eIF4E3c69a、eIF4E3w86a表达质粒后，Hela细胞的eIF4E3或突变体mRNA水平分别提高了4705.88、7083.51、8307.79倍(P<0.01)，C33a细胞分别提高了3467.99、2592.06、6038.12倍(P<0.01)。 （2）Western Blot结果：内源性eIF4E3蛋白在Hela和C33A宫颈癌细胞中呈低表达水平；与空载组相比，转染eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3C w86a表达质粒后, eIF4E3或突变体蛋白分子量稍大（含EGFP），在Hela细胞中其水平分别提高了6.24、40.10、38.60倍(P<0.01），在C33a细胞中其水平分别提高了7.30、25.03、17.21倍(P<0.01）。 3.转染eIF4E3野生型和突变体质粒后对宫颈癌细胞增殖、克隆形成率、细胞周期、凋亡、侵袭能力的影响 （1）与空载组相比，按24h、48h、72h、96h顺序，稳转过表达eIF4E3后， Hela细胞的增殖抑制率分别为20.60%、35.86%、24.58%、23.50%（P﹤0.01）， C33a细胞的增殖抑制率分别为16.50%、31.86%、24.15%、17.91%（P﹤0.01）；稳转过表达eIF4E3C69a后，Hela细胞的增殖抑制率分别为16.43%、31.33%、20.23%、21.15%（P﹤0.01），C33a细胞的增殖抑制率分别为16.25%、24.47%、18.79%、12.60%（P﹤0.01）；稳转过表达eIF4E3C w86a后，Hela细胞的增殖抑制率分别为2.31%、4.53%、10.15%、12.29%（P﹥0.05），C33a细胞的增殖抑制率分别为2.72%、5.53%、8.10%、10.24%（P﹥0.05）。 （2）与空载组相比，稳转过表达eIF4E3后，Hela细胞克隆形成率下降56.09%（P<0.01），C33A细胞克隆形成率下降56.06%（P<0.01）；稳转过表达eIF4E3C69a后，Hela细胞克隆形成率下降37.44%（P<0.05），C33A细胞克隆形成率下降28.79%（P<0.05）；稳转过表达eIF4E3C w86a后，Hela细胞克隆形成率下降14.39%（P﹥0.05），C33A细胞克隆形成率下降15.18%（P﹥0.05）。 (3)与空载组相比，稳转过表达eIF4E3质粒后，Hela细胞在G0/G1期下降10.07%（P﹥0.05）、在S期上升49.55%（P﹤0.05）、在G2/M期下降58.03%（P﹤0.01），C33a细胞在G0/G1期下降9.18%（P﹥0.05）、在S期上升42.24%（P﹤0.05）、在G2/M期下降44.88%（P﹤0.05）；稳定转染eIF4E3C69a突变体质粒后，Hela细胞在G0/G1期下降5.59%（P﹥0.05）、在S期上升26.19%（P﹤0.05）、在G2/M期下降27.50%（P﹤0.05），C33a细胞在G0/G1期下降4.89%（P﹥0.05）、在S期上升22.63%（P﹤0.05）、在G2/M期下降27.31%（P﹤0.05）；稳定转染eIF4E3W86a突变体质粒后，Hela细胞在G0/G1期下降1.95%（P﹥0.05）、在S期上升9.56%（P﹥0.05）、在G2/M期下降11.19%（P﹥0.05），C33a细胞在G0/G1期下降4.80%（P﹥0.05）、在S期上升12.38%（P﹥0.05）、在G2/M期下降3.02%（P﹥0.05）。 (4)与空载组相比，稳转过表达eIF4E3后，Hela细胞凋亡率提高了99.33%（P﹤0.01），C33a细胞凋亡率提高了80.89%（P﹤0.01）；稳转过表达eIF4E3C69a后，Hela细胞的凋亡率提高了80.54%（P﹤0.05），C33a细胞凋亡率提高58.49%（P﹤0.05）；稳转过表达eIF4E3W86a后，Hela细胞凋亡率率为10.74%（P﹥0.05），C33a细胞凋亡率为11.07%（P﹥0.05）。 （5）与空载组相比，稳转过表达eIF4E3后，Hela细胞侵袭抑制率为62.8%（P﹤0.01），C33a细胞侵袭抑制率为56.2%（P﹤0.01）；稳转过表达eIF4E3C69a后，Hela细胞侵袭抑制率为23.4%（P﹤0.01），C33a细胞侵袭抑制率为29.6%（P﹤0.01）；稳转过表达eIF4E3W86a后，Hela细胞侵袭抑制率为19.8%（P﹤0.05）， C33a细胞侵袭抑制率为17.5%（P﹤0.05）。 结论： 1.成功构建eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3W86a真核过表达载体。 2. eIF4E3在宫颈癌细胞株Hela、C33a中呈低水平表达，稳定转染eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3C W86a过表达质粒后，eIF4E3及突变体的mRNA和蛋白水平显著上调，表明稳定转染野生型eIF4E3及突变体eIF4E3C69a、eIF4E3C W86a细胞系的建立成功。 3.过表达eIF4E3质粒，显著抑制了Hela和C33a细胞的增殖、克隆形成率、细胞周期S期进展、侵袭并诱导了细胞的凋亡，表明eIF4E3是宫颈癌的潜在抑癌基因。 4.过表达eIF4E3C69a和eIF4E3w86a质粒，与过表达eIF4E3质粒相似，亦抑制了Hela和C33a细胞的增殖、克隆形成能力、细胞周期S期进展、抗凋亡、侵袭。但是，抑制程度显著不同，其中eIF4E3C69a抑制能力大约是eIF4E3抑制能力的50%，eIF4E3w86a的抑制能力仅为eIF4E3抑制能力的10%以下，实际上eIF4E3w86a与NC对照或Mock对照对Hela和C33a细胞的作用无明显差别（P<0.05）。结果提示，两突变体的eIF4E3功能下降，尤其是eIF4E3w86a，几乎丧失了eIF4E3功能。至于突变体还有部分eIF4E3的功能或eIF4E3的功能痕迹，可能是由于原存的内源性eIF4E3在起作用。 5.目前对eIF4E3的作用和作用机制的研究甚少。除本课题组发表的一篇论文外，未查到eIF4E3在宫颈癌中的其他研究报道。本文建立的稳定转染的野生型eIF4E3和突变体eIF4E3C69a及eIF4E3w86a的宫颈癌细胞株Hela和C33a，为进一步研究eIF4E3的作用和作用机制打下了重要基础。