论文部分内容阅读
RAR1和SGTl是植物抗性(resistance, R)基因介导的抗病防卫途径中的两个重要信号元件,在R蛋白下游和活性氧产生之间发挥作用。为探索Rarl和Sgtl类基因在异源植物体内的表达特性及其在植物抗病反应方面的功能,开展了本研究。本文研究了rDNA-ITS序列在苹果轮纹病病原菌分类鉴定中的作用,以及该序列的变异情况与菌落生物学特性、致病能力间的联系,筛选了离体条件下诱导产生苹果轮纹病分生孢子的有效途径,为转基因植株抗病性检测提供了材料。在实验室原有转化体系的基础上,采用农杆菌介导法,将从抗病性较强的湖北海棠(Malus hupehensis)中克隆的MhRarl基因和MhSgtl基因,分别转入模式植物烟草(Nicotiana tabacum)和感病苹果品种长富6号(Nagafuji No.6).并通过烟草灰霉病病原菌(Botrytis cinerea Pevs.)和苹果轮纹病病原菌[Botryosphaeria berengeriana de Notf. sp. Piricola (Nose)],对转基因植株进行侵染,以验证两种基因在烟草和苹果抗病反应中的作用。研究结果如下：1.以来自不同地区的10个苹果轮纹病菌株为研究对象,采用通用引物ITS1和ITS4对rDNA-ITS区进行PCR扩增和克隆测序,通过序列比对发现有5个菌株在ITS1区序列上存在变异的碱基。通过同源性比较和生物信息学分析,构建了系统进化树,发现10个菌株均属于轮纹病病原菌第I亚类。检测了变异菌株菌落的生长速度、产孢能力和致病效果与普通菌株的差异。发现碱基变异程度较大的菌株,其菌丝生长速度、产孢能力和侵染效果,都要优于变异较少或未发生变异的菌株。同时研究了培养基种类、pH、培养温度、光源和光照条件对菌丝体生长和分生孢子发生的影响以及刮除菌丝体对分生孢子发生的影响。综合比较后确定轮纹病菌落生长的适宜条件为25-30℃、pH5.0-7.0的马铃薯培养基,接种后在黑光灯和日光灯下交替培养有利于分生孢子囊和分生孢子的快速产生；菌丝体生长到一定程度后,刮除菌丝体对产生大量分生孢子有显著促进作用。2.用农杆菌介导法将上述两种基因分别转入烟草,抗性苗诱导率为61.02%和55.58%。对Hyg阳性株系依次进行PCR和RT-PCR检测,最终筛选出11个转MhRarl烟草株系和8个转MhSgtl株系。通过对接种病菌后离体叶片和植株进行抗病性鉴定和抗氧化酶(SODPODCAT)活性检测,发现转化两种基因的烟草的离体叶片可以表现出对灰霉病的抗性,而且被侵染后转基因植株体内三种抗氧化酶活性和MDA含量的指标都高于对照。转化两种基因的烟草植株经自交结实产生的T1代种子同样表现出Hyg抗性,且幼苗在灰霉病侵染下生长良好,初步说明转基因特性能够稳定遗传,而且两种基因的转化具有一定的提高植株抗真菌病害的能力。3.根据实验室已有的再生和转化体系,利用农杆菌介导法将MhRarl和MhSgtl基因分别转入富士苹果,转化率为2.47%和1.53%。对Hyg阳性植株依次进行PCR和RT-PCF检测,最终筛选出6个转MhRarl苹果株系和3个转MhSgtl株系。对苹果轮纹病孢子侵染后的转基因植株,进行了体内抗氧化酶活性(SODPODCAT)和MDA含量的检测。发现苹果转基因植株在被病菌侵染后抗氧化酶活性迅速升高,而MDA变化则相对平缓,从而初步验证了两种基因在苹果中的表达特性和提高苹果抗病能力的应用潜力。