沙门氏菌属于肠杆菌科细菌,由此类细菌引起的各种动物疾病称为沙门氏菌病,除初生动物,人畜感染后一般呈无症状带菌状态,长期排菌,污染肉蛋产品,同时它们也可表现为有临床症状的致死疾病,可能加重病情或者增加死亡率,或者降低动物生产力等,对养殖业的经济效益影响重大。目前,鸡肠炎沙门氏菌污染禽蛋肉产品在全球范围内已是很严重的食品卫生问题。日、美等发达国家发生的食物中毒事件中很多都是由沙门氏菌引起的,而肠炎沙门氏菌感染渐渐超越鼠伤寒沙门氏菌成为其最主要的病原菌。SEF14菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌以及相近的D-群沙门氏菌中,主要是肠炎沙门氏菌和都柏林沙门氏菌中,而都柏林沙门氏菌属于偏嗜性沙门氏菌,其临床感染的报道较少,主要发生于牛羊。SEF14菌毛,与某些广泛分布于革兰氏阴性菌中的菌毛结构共性功能不同,这种特异性分布的菌毛结构可能有其独特的功能。目前,关于SEF14菌毛功能研究相对较少,对其在肠炎沙门氏菌致病过程中的作用存在一定争议。本试验拟以SEF14菌毛为研究对象,从染色体基因序列变化上探寻SEF14菌毛特异性表达于某些D-群沙门氏菌,特别是肠炎沙门氏菌的原因；鉴于目前临床上无简单易行的肠炎沙门氏菌特异性检测方法,根据SEF14菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌这一特点,本试验体外重组表达SEF14菌毛主要亚单位蛋白SEFA,并以此建立间接ELISA方法特异性检测临床肠炎沙门氏菌感染；构建肠炎沙门氏菌SEF14菌毛亚单位突变株,通过动物感染试验以及体外系列细胞试验揭示其在肠炎沙门氏菌致病过程中的一定作用,旨在阐述肠炎沙门氏菌的隐性带菌感染相关性,借助构建的突变株探索中国地方品种家禽与肠炎沙门氏菌的易感性之间的关联,试图为家禽的抗病育种寻找新的线索。1 SEF14菌毛操纵子在肠炎沙门氏菌和相近D-群沙门氏菌中的变异本试验部分用PCR方法检测了18株鸡白痢沙门氏菌,11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌株中SEF14菌毛操纵子亚单位基因sefA, sefD以及调控基因sefR存在与变异情况。结果表明：从11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌染色体DNA中能成功扩增sefA, sefD以及sefR基因；从18株鸡白痢沙门氏菌能成功扩增sefA基因,但只有分离于1980年之前的7株分离菌能成功扩增sefD和sefR基因,而另11株1980年后分离菌PCR扩增却无任何产物。PCR产物测序结果表明,11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌株中sefA, sefD以及sefR基因和已发表的序列100%同源；分析比对分离于1980年之前的7株鸡白痢沙门氏菌sefD基因测序结果,发现在196位点发生碱基缺失,造成阅读框移码,在氨基酸71位点处产生终止密码子。优化体外菌毛表达的培养条件,体外菌毛抽提和鉴定试验证明：肠炎沙门氏菌以及都柏林沙门氏菌体外能很好表达SEF14菌毛,但鸡白痢沙门氏菌却无任何表达迹象。SEF14菌毛操纵子结构基因sefA, sefD以及调控基因sefR在不同沙门氏菌中的变异情况可能是SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌、都柏林沙门氏菌中特异性表达的原因之一。2肠炎沙门氏菌SEF14菌毛主要亚单位sefA的克隆、表达以及免疫活性检测据肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子亚单位sefA基因序列设计一对引物,利用PCR技术从国内标准株50336中扩增sefA基因,并按预定的阅读框插入表达性载体pET22b+中,获得重组质粒pETsefA,经限制性内切酶酶切消化结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列大小为498bp,与已发表的sefA结构编码序列完全一致。重组质粒pETsefA转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)并能获得高效诱导表达,对菌体裂解上清液通过SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定,该重组菌可以表达大小为15.2kD的可溶性重组蛋白rSEFA。纯化rSEFA免疫小鼠得到的高免血清与标准株50336感染小鼠血清一样,在Western-blotting中,均能识别标准株肠炎沙门氏菌SEF14菌毛蛋白以及纯化的重组蛋白rSEFA,说明体外表达的rSEFA蛋白有较好的免疫原性和反应原性,为后续建立肠炎沙门氏菌特异性检测方法提供基础。3肠炎沙门氏菌间接ELISA检测方法的建立建立和优化了重组蛋白rSEFA介导的间接ELISA方法特异性检测肠炎沙门氏菌血清抗体。确定了其抗原最佳包被量为7.5μg/ml,血清最适稀释度1：100,作用时间为60min;酶标二抗最适稀释度为1：4000,作用时间为60min;判定标准为OD值≥0.346,基于rSEFA介导的间接ELISA有较好的特异性,能特异性识别肠炎沙门氏菌和都柏林沙门氏菌感染血清,不能识别相近的鸡白痢沙门氏菌感染血清,此方法与菌体凝集反应同时检测临床随机血清样品100份,两者阳性率分别为67%和54%,结果符合率为80.6%。这一方法的建立对肠炎沙门氏菌特异性抗体检测有潜在的应用前景,试剂盒的完善将填补国内相关研究的空白,为家禽种群肠炎沙门氏菌净化工作以及日常血清筛查提供了极大的便利。4基于Red同源重组和高效自杀性载体系统构建肠炎沙门氏菌SEF14菌毛亚单位突变株Red同源重组系统和高效自杀性载体系统都能对革兰氏阴性菌染色体直接进行修饰,本试验利用上述两种系统敲除4株不同来源肠炎沙门氏菌(X) SEF14菌毛操纵子亚单位sefD或sefA基因,包括国际国内标准株(SD-2,50336),鸡源以及人源临床分离株(S.09,SE43),并对构建肠炎沙门氏菌突变株方法进行比较。基于含sefD基因同源臂片段和抗生素表达盒的PCR扩增产物,利用Red同源重组系统,电转化PCR扩增产物至不同源肠炎沙门氏菌各菌株,通过同源臂发生同源重组交换缺失sefD基因,一步法构建各菌株sefD基因突变株XAsefD::Cat(氯霉素抗性基因)。在二次重组中利用携带FLP位点特异性重组酶的温度敏感性质粒,去除上述突变株中的筛选用抗性基因标志,获sefD基因突变株X△sefD,结合PCR扩增和序列鉴定,证明上述各突变株正确构建。在高效自杀性载体系统中,根据sefA基因两端的已知序列,PCR扩增邻近sefA基因左右两侧各1000bp大小的同源臂DNA片断,然后将其克隆入自杀性载体质粒pRE112中,将成功构建的含同源臂DNA片断的重组自杀质粒pRE1122电转化至不同源肠炎沙门氏菌各菌株,重组质粒和染色体DNA通过同源臂发生同源重组交换缺失sefA基因,自杀性载体质粒含有sacB基因,在蔗糖存在时不能稳定传代,在二次重组中通过蔗糖培养基传代筛选抗性敏感的sefA突变株,PCR扩增和测序鉴定sefA突变株的正确构建。目前已成功构建国际、国内标准株,鸡源和人源国内分离株SEF14菌毛操纵子亚单位sefD、sefA和sefAsefD基因缺失株。比较两个系统在肠炎沙门氏菌基因缺失株构建上的应用：Red同源重组系统能将PCR产物一步法直接转化肠炎沙门氏菌,在重组酶的作用下,通过较短同源臂发生同源重组交换,但对PCR产物和感受态细胞的质量要求很高,一次重组效率很低,而二次重组过程中去除抗性选择标志则相对简单、高效。自杀性载体系统若将构建好的含同源臂DNA片断的重组质粒转化宿主菌,其一次重组效率高,二次重组也只需蔗糖培养基中传代丢失抗性质粒。但Red同源重组系统将在染色体中残留FRT位点；而自杀性载体系统在染色体中可不留任何痕迹。两个系统都能对不同源肠炎沙门氏菌染色体进行直接修饰,且易删除抗性选择标志,但传统的高效自杀性载体系统需构建含同源臂的打靶质粒,多次酶切连接,操作繁琐,Red同源重组系统更方便快捷,省时省力。基于SEF14菌毛操纵子亚单位sefD、sefA和sefAsefD双基因缺失株成功获得,为进一步深入研究肠炎沙门氏菌SEF14菌毛与机体相互作用的分子致病机理及对该病防制奠定了一定基础。5肠炎沙门氏菌和其SEF14菌毛突变株对Balb/c小鼠和中国地方品种鸡的感染以肠炎沙门氏菌标准株50336和突变株50336△sefA、50336△sefD和双突变株50336△sefA△sefD为生物材料,以腹腔注射和颈部皮下注射为感染途径,测定标准株及突变株对6周龄Balb/c小鼠的半数致死量(LD50)以及上述菌株对中国地方品种鸡-清远麻鸡(1日龄)的感染情况,以探讨SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌致病过程中的作用。结果显示,标准株50336以及突变株50336△sefA、50336△sefD6周龄Balb/c小鼠的LD50分别为19.95 cfu,7.94 cfu,7.94cfu,说明SEF14菌毛不同亚单位蛋白影响肠炎沙门氏菌对Balb/c小鼠的LD50,SEF14菌毛亚单位基因突变株50336△sefA和50336△sefD增强肠炎沙门氏菌对Balb/c小鼠毒力。对1日龄清远麻鸡的感染结果显示亚单位基因突变株50336△sefA和双突变株50336△sefA△sefD感染力更强,与标准株50336感染组相比,其死亡率增高,并严重影响雏鸡的增重。肠炎沙门氏菌以及相应突变株感染小鼠和清远麻鸡后,感染菌脏器分布广泛,细菌的分离鉴定结果表明,试验期间在感染动物脏器肝、肾、脾、肺、盲肠以及小肠中都能成功分离攻毒菌株。中国地方鸡品种资源丰富,遗传背景多样,抗病能力差异较大,根据肠炎沙门氏菌以及相应SEF14菌毛突变株对地方品种鸡的感染试验,检测清远麻鸡对不同菌株的感染力,为中国地方品种鸡的抗病育种提供线索。6SFF14菌毛在肠炎沙门氏菌致病过程中作用初探致病菌黏附于易感宿主细胞是成功感染的第一步,巨噬细胞在肠炎沙门氏菌感染中有着重要作用,肠炎沙门氏菌入侵巨噬细胞并能在其中正常生长繁殖,可能是肠炎沙门氏菌在感染宿主体内长期存在并扩散的原因之一。本试验基于上述构建的突变株,分析比较4株肠炎沙门氏菌(X)和其对应的SEF14菌毛亚单位基因突变株X△sefA、X△sefD以及双突变株X△sefAsefD与肠上皮细胞系IPEC-J2的黏附作用,小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用和野生菌以及相应突变株在小鼠腹腔巨噬细胞内的存活作用。肠上皮细胞的黏附试验结果表明,所有野生株及其相应的突变株在1h和4h内都能很好的黏附上皮细胞,且随着时间的增加,黏附数量增多,但此时间内,野生株以及相应突变株在黏附数量上差异不显著。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验和存活试验结果表明：活化的小鼠腹腔巨噬细胞对相应突变株X△sefA、X△sefD以及双突变株X△sefA△sefD的吞噬作用加强,其在小鼠巨噬细胞中的存活能力提高,这一结果可能意味着SEF14菌毛并不特异性介导肠炎沙门氏菌与肠上皮细胞的粘附作用,或者不是粘附的主要作用因子,可能与其在巨噬细胞中的作用有关,借助SEF14菌毛的作用,肠炎沙门氏菌能更好的作用于巨噬细胞并在巨噬细胞中存活,利于其隐性感染和长期排毒。