目的:探讨不同强度的超声微泡破坏技术对兔心肌细胞的生物学效应,优化出影响心肌细胞的最佳辐照条件,在此基础上建立兔心肌缺血/再灌注模型,通过携白细胞介素-8(IL-8)单克隆抗体微泡联合超声破坏技术对心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)进行靶向性研究。方法:1.超声辐照对兔心肌组织细胞的生物学效应:20只日本大耳白兔随机分为4组,每组5只。经耳缘静脉注入0.05ml/kg微泡造影剂,不同强度超声辐照((1)0.5w/cm2组;(2)0.75w/cm2组;(3)1.Ow/cm2组;(4)1.5w/cm2组)兔心肌组织,辐照时间30s,中间间隔10s,持续辐照1min。超声辐照结束后,处死动物,取局部心肌组织进行病理组织HE染色观察兔心肌细胞改变情况。2.兔心肌缺血/再灌注模型的建立:选取90只日本大耳兔随机分为3组:关胸对照组15只(A组,随机分成U0、U1、U2组)、开胸对照组15只(B组,随机分成U0、U1、U2组)、缺血/再灌注组60只(C组,分成T2-5时段,每一时段分成U0、U1、U2组)。采用阻断冠状动脉左前降支30min后解除阻断使其再灌注制备心肌缺血/再灌注损伤动物模型;B组开胸后同一部位只穿线不阻断;A组不做任何处理。分别于术前,缺血30 min,再灌注30 min、60 min、120 min、180 min对三组兔行心电图和常规超声心动图检查,确定兔发生心肌急性缺血再灌注损伤。3.靶向声学造影剂的制备及鉴定:采用生物素法将IL-8单克隆抗体偶联于Targestar SA微泡表面,显微镜下观察微泡大小、形态及分散度并通过玻片凝集实验及荧光染色实验证明偶联是否成功。4.超声微泡破坏过程:对三组兔行常规心脏超声检查后,随后对每组兔U1、U2组用即时配制的携IL-8单克隆抗体的靶向造影剂行心肌声学造影检查,3min时即用低功率超声破泡仪进行微泡爆破,辐照时间30s,中间间隔10s,持续辐照时间1min,分别取得辐照前、后动态图像后脱机应用QLAB软件进行分析。5.将上述各组兔处死取心肌组织用于酶联免疫吸附法(ELISA),以检测心肌组织中IL-8含量。结果:1.超声辐照对兔心肌组织细胞的生物学效应:0.5w/cm2强度超声辐照后心肌组织无水肿,无出血;0.75 w/cm2强度超声辐照后心肌组织轻微水肿,无出血;1.Ow/cm2强度超声辐照后心肌组织轻微出血,但少量炎症细胞浸润;1.5w/cm2强度超声破坏微泡后心肌组织出血,炎症细胞一定程度浸润。2.兔心肌缺血再灌注损伤模型的建立:术前观察三组兔二维超声、心电图均无异常。A组兔不做任何处理。心电图检测:C组兔心率稍有增快,梗30minST段抬高,再灌注45min ST段开始下降;B组兔心率稍增快,ST段未见变化。超声观察:梗30min时段及再灌注30min时段兔超声观察室壁运动幅度较术前及A、B组均减低;C组其余时段及B组兔假手术组室壁运动与术前相比未见明显异常。3.靶向声学造影剂的制备及鉴定:玻片凝集实验及免疫荧光染色证实IL-8单克隆抗体已成功偶联到Targestar SA微泡表面。偶联后的微泡与未偶联的微泡浓度、大小、形态、性状基本相似,说明了通过共价偶联法制备的声学造影剂其物理及生物性状未见明显变化,故可以作为声学造影剂作用于生物体内。4.超声微泡破坏治疗:超声辐照前:关胸对照组、开胸对照组造模节段前壁超声视频强度与其未损伤节段侧壁及缺血/再灌注组未损伤节段侧壁无明显差异(P>0.05);均明显小于缺血/再灌注组造模节段前壁(P<0.05)。缺血/再灌注组造模节段前壁超声视频强度随着再灌注时间的延长,超声视频强度逐渐增加,再灌注120min时视频强度达最高峰,且明显高于未损伤节段侧壁(P<0.05);而各时段之间未损伤节段侧壁视频强度无明显差异(P>0.05)。超声辐照后:关胸对照组、开胸对照组造模节段前壁0.5w/cm2组超声视频强度与0.75w/cm2无明显差异(P>0.05);关胸对照组、开胸组及缺血/再灌注组未损伤心肌节段侧壁0.5w/cm2组超声视频强度与0.75w/cm2无明显差异(P>0.05)。缺血/再灌注组造模节段前壁同一时段不同强度超声辐照,0.75w/cm2组超声视频强度均低于0.5w/cm2组(P<0.05),且均低于相同节段辐照前超声视频强度(P<0.05)。同一辐照强度下,随再灌注时间的延长,各时段视频强度逐渐增加,再灌注120 min最高。超声视频强度差值(VID):关胸对照组、开胸对照组心肌造模节段前壁不同强度超声辐照,VID值无明显差异(P>0.05);而同一强度辐照条件下关胸对照组、开胸对照组VID值均小于缺血/再灌注组各时段(P<0.05)。缺血/再灌注组同一时段不同强度超声辐照下,0.75w/cm2 VID值均高于0.5w/cm2组(P<0.05)。而同一强度辐照条件下,缺血/再灌注组各时段之间VID值未见明显差异(P>0.05)。超声视频强度变化率:关胸对照组、开胸对照组心肌造模节段前壁不同强度超声辐照,视频强度变化率无明显差异(P>0.05);关胸对照组、开胸对照组同一强度辐照下超声视频强度变化率均小于缺血/再灌注组各时段(P<0.05)。缺血/再灌注组心肌造模节段前壁同一时段不同强度超声辐照下,0.75w/cm2组超声辐照视频强度变化率均高于0.5w/cm2组(P<0.05);而同一强度辐照条件下,缺血/再灌注组各时段随着再灌注时间的延长,超声视频强度变化率逐渐减小。5.兔心肌组织ELISA分析:未经超声辐照(Uo组):关胸对照组心肌组织中的IL-8含量低于开胸对照组,差异无统计学意义(P>0.05)。关胸对照组、开胸对照组心肌组织中IL-8含量均低于缺血/再灌注组(P<0.05)。而缺血/再灌注组未经辐照处理的心肌组织中的IL-8含量随着心肌再灌注时间的延长心肌细胞产生的IL-8含量也逐渐增加,于再灌注120min时达峰值,说明经再灌注损伤处理后的心肌细胞可释放大量 IL-8。超声辐照后(U1、U2组):关胸对照组、开胸对照组0.75w/cm2强度超声辐照后心肌组织中IL-8含量低于0.5w/cm2组,但差异无统计学意义(P>0.05)。缺血/再灌注组同一时段,0.75w/cm2组心肌组织中IL-8量低于0.5w/cm2组(P<0.05);同一强度辐照后,随着再灌注时间的延长,心肌组织中的IL-8量逐渐增加。超声辐照心肌组织IL-8含量差:关胸对照组、开胸对照组不同强度超声辐照心肌组织IL-8含量差差异无统计学意义(P>0.05);同一强度超声辐照下,关胸对照组、开胸对照组IL-8含量差值均低于缺血/再灌注组各时段(P<D.05)。缺血/再灌注组同一时段不同强度超声辐照下,0.75w/cm2 IL-8含量差值均高于0.5w/cm2 组(P<0.05)。超声辐照心肌组织IL-8中和率:关胸对照组、开胸对照组心肌组织IL-8中和率,0.75w/cm2组与0.5w/cm2组差异无统计学意义(P>0.05);缺血/再灌注组不同强度辐照,0.75w/cm2组心肌组织IL-8中和率均高于0.5w/cm2组(P<0.05);而同一辐照强度下,随着再灌注时间的延长,IL-8中和率逐渐减小。6.心肌组织中的IL-8含量差与超声视频强度均值差(VID)值相关性分析发现两者相关系数(rU1=0.803,rU2=0.857),说明两者之间存在强的相关性。结论1.超声辐照对兔心肌组织的生物学效应:不同强度超声破坏微泡造影剂能使兔心肌组织产生不同程度的生物学效应;超声强度在1.0-1.5 w/cm2能使心肌轻度损伤时引起一定程度的炎症反应。2.兔心肌缺血再灌注损伤模型的建立:通过阻断兔冠状动脉左前降支30 min后解除阻断可成功建立心肌缺血/再灌注损伤动物模型,为下一步进行超声靶向微泡破坏实验提供动物模型。3.靶向声学造影剂的制备及鉴定:通过玻片凝集实验与免疫荧光实验可得出IL-8单克隆抗体已成功偶联到Targestar SA微泡外壳表面。4.心肌缺血再灌注组兔造模节段前壁超声视频强度均高于未损伤节段侧壁、关胸对照组及开胸对照组,且再灌注120 min视频强度达最高峰,说明IL-8单克隆抗体可特异性结合IL-8,IL-8抗体在炎症区域达到高聚集。5.超声辐照治疗发现:心肌缺血/再灌注组同一时段造模节段超声辐照强度越大,超声视频强度差值(VID)越大,超声视频强度变化率越高,中和IL-8量越多;同一辐照强度,随着心肌损伤程度的增加,超声视频强度差值(VID)变化差异不明显,中和IL-8量未见明显差异,但超声视频强度变化率逐渐降低。说明超声微泡破坏治疗成功将IL-8单克隆抗体靶向导入到心肌缺血再灌注损伤炎症区域,同时又可抑制炎症反应(中和IL-8抗体),减低再灌注损伤,且辐照强度越大,越早干预治疗,效果越明显。6.心肌组织ELISA分析发现:随着心肌细胞损伤程度的增加,心肌细胞的IL-8量也逐渐增加,再灌注120 min时达峰值。超声辐照治疗,心肌缺血/再灌注组同一时期,超声辐照强度越大,中和的心肌组织中IL-8量越多,;同一辐照强度下,随着损伤程度的增加,中和的心肌组织中IL-8量未见明显差异,但IL-8中和率逐渐降低。IL-8中和率代表着中和的IL-8含量占心肌组织总IL-8含量的比例,中和率越大,同一时段内中和的IL-8量越多,故在不损伤心肌组织的前提下,超声辐照强度越大,干预时间越早,减轻炎症反应的效果越明显。7.心肌组织中中和的IL-8量与超声视频强度均值差(VID)值相关性分析发现两者相关系数rU1=0.803、rU2=0.857,说明两者之间存在较强的相关性。