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体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和胚胎培养(IVF)等技术是体外生产家畜、实验动物甚至野生动物胚胎的有效技术方法,是提高家畜繁殖性能的重要技术途径,因此,全世界许多研究人员开展了多种动物体外胚胎技术研究,体外胚胎生产效率不断提高。卵母细胞IVM时卵母细胞质量与发育能力是决定体外生产胚胎(IVP)效率的重要因素。体外实验表明,卵母细胞发育与其周围包裹得颗粒细胞之间相互影响,不同动物如小鼠、羊和猪的颗粒细胞(CCs)都对其卵母细胞发育能力具有重要意义,而卵母细胞分泌因子如生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)与CCs细胞凋亡息息相关,进而影响卵母细胞自身质量和受精后胚胎的发育。IVM时培养液中添加一定浓度的外源性BMP15和GDF9,CCs中细胞凋亡显著下降,因此,GDF9和BMP15可能是卵母细胞体外成熟过程中调节CCs细胞凋亡的重要因素。然而,不同动物中BMP15和GDF9调节CCs凋亡的机理可能不尽相同。因此,本论文研究牛体外成熟卵母细胞分泌因子BMP15和GDF9的表达,添加外源BMP15和GDF9对CCs相关促凋亡和抗凋亡基因表达的影响,以及外源GDF9调控CCs凋亡的可能信号通路。本论文包括三个实验:(1)体外培养牛卵母细胞BMP15和GDF9基因表达的研究。分别研究不同培养时间0h(GV)、16h(MII)、24h(MII)BMP15和GDF9基因m RNA的表达;(2)体外添加外源BMP15和GDF9对体外培养牛卵母细胞颗粒细胞CCs凋亡影响的研究。培养液中分别添加BMP15和GDF9的浓度为0BMP15+GDF9(对照组);100ng/m L BMP15;100ng/m L GDF9;100ng/m L BMP15+100ng/m L GDF9。培养24h后,定量RT-PCR分析CCs细胞中促凋亡基因(Bim、Bax、p53),和抗凋亡基因(Bcl2)m RNA的表达,Western Blot检测Bim和p53蛋白的表达;(3)GDF9调控CCs凋亡通路的研究。培养液中添加100ng/ml的GDF9,分别添加抑制剂SB203580、PDTC、SB431542或者LY294002作用1h后,Western Blot检测Bim蛋白表达。实验结果表明:(1)IVM期间BMP15和GDF9 m RNA在牛卵母细胞中表达,并在16h(MII)达到最大;(2)外源性GDF9能显著降低Bim m RNA和蛋白在牛卵丘细胞中的表达(3)GDF9可能通过SMAD、PI3K途径降低Bim的表达。