福建余甘子(Phyllanthus emblica L.)遗传资源的RAPD分析

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本研究以福建省34份余甘子遗传资源为材料,摸索出适合余甘子叶片基因组DNA的提取方法;建立和优化了余甘子RAPD反应体系;筛选出具有品种(或单株)特异性的RAPD标记;采用RAPD标记,结合聚类分析,进行了福建省余甘子遗传资源的亲缘关系与遗传多样性研究。主要研究结果如下: 一、余甘子叶片DNA提取方法的建立。针对余甘子叶片富含多酚类、多糖、色素等物质,易与DNA结合成复合物,难溶解。又易抑制Taq酶活性,从而影响PCR扩增。本研究采用改良的SDS法,以新鲜幼嫩的余甘子叶片为材料,同时又在提取液中加入3%PVP,有效地克服消除了酚类物质的干扰,从余甘子叶片中提取了较高纯度和产量的DNA,适宜作为余甘子的RAPD分析。 二、余甘子RAPD反应体系的优化。在参考一般RAPD分析的反应程序的基础上,经过反复试验,确定适宜的PCR扩增程序为:94℃,预变性4min;94℃,1min→38℃,1.5min→72℃,2min,45个循环:72℃,10min。优化的余甘子RAPD反应体系为:在扩增反应总体积25μL中,包含0.6mmol·L-1Mg2+、500μmol·L-1dNTP、300 nmol·L-1引物、25ng模板DNA、1.25U Taq DNA聚合酶。 三、余甘子RAPD标记的多态性程度分析。采用20个具特异扩增的多态性引物对福建省34份余甘子基因型进行扩增,20个引物,在34份供试材料中总共扩增出259个位点,且均是多态的,多态性程度达100%,平均每个引物扩增12.95个位点。各供试材料之间的遗传距离范围为0-1,其中栽培品种与野生资源之间遗传距离在0.43—1之间;莆田余甘资源与惠安余甘资源之间遗传距离为0.27—0.99。 四、品种(或单株)特异性RAPD标记的筛选与品种鉴别。采用20个具特异扩增的多态性引物对所有供试材料进行扩增,获得了19个引物对23份材料扩增的RAPD特征标记47个,17个引物在36对材料上共扩出36个共享特征RAPD标记。五、福建余甘遗传资源的RAPD标记的聚类分析。采用ED(欧氏距离)法进行聚类分析则可将福建34份余甘子遗传资源明显划分为惠安余甘和莆田余甘两大类.而采用Cosine距离法计算样品间的距离则全部供试的34份余甘子基因型可明显区分为三大类,栽培品种全部归为一大类,惠安野生余甘子为另一大类,莆田野生一号单独归为一类。
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