论文部分内容阅读
背景:短暂性脑缺血(TIA)的反复发作,在48 h内发生缺血性脑病几率大约为50%,危险系数比较大,成为缺血性脑病的威胁因素。而在溶栓时间窗内通过影像学检查不容易将TIA和缺血性脑病区分开来,而血液标志物具备了经济有效和无创性的优点,并且可以用于疾病的诊断。因此本研究主要目的是为找到有效的血浆外泌体miRNA作为诊断TIA的血液标志物。方法:首先,制作大鼠大脑中动脉闭塞(MCAo)模拟大鼠TIA模型,收集造模后大鼠的血浆及脑脊液样本,使用HE染色及TUNNEL染色对缺血后大鼠脑组织神经元细胞的病理变化进行评估。其次,通过试剂盒从血浆和脑脊液样本中提取外泌体总RNA,使用深度测序检测大鼠血浆中的外泌体miRNA表达,并筛选出差异表达显著的miRNA。第三,本研究通过实时定量聚合酶链反应(PCR)和数字PCR(ddPCR)分别检测血浆和脑脊液中外泌体的miRNA表达水平,选择血浆和脑脊液表达趋势相对一致的外泌体miRNA,然后对其进行生物信息学分析。最后,通过制作(ROC)曲线和计算曲线下面积(AUC)以评估miRNA在诊断大鼠中TIA中的价值。结果:第一,TUNEL染色结果最终提示缺血5分钟组的脑组织切片上能观察到的极少数量TUNEL阳性细胞,而缺血10分钟的TUNEL阳性细胞的数量相对于缺血5分钟阳性细胞数量多,缺血后2小时的脑组织切片上可观察到TUNEL阳性细胞是数量最多的细胞。由此可知,缺血时间不一致则TUNEL染色后的阳性率也相对不一致,缺血5min和假手术组的阳性率低于缺血10 min组和缺血2 h的阳性率。HE染色结果提示假手术组脑组织切片上的神经元细胞形状、大小及结构均正常;缺血5分钟组开始出现部分的神经元细胞萎缩,出现嗜酸性坏死,萎缩性坏死、细胞核固缩、深染;在缺血10分钟组萎缩的神经元细胞数量增多,胞核固缩明显,核仁消失,萎缩的神经元细胞数量较前增加,神经元细胞结构紊乱;缺血2小时组可见很多的神经元细胞坏死,纤维破碎溶解、纤维网呈空泡化以及细胞间质水肿。第二,我们通过透射电镜、Nano-ZS鉴定外泌体样本的形态、平均粒径以及粒径主峰均在Exosome的粒径范围内(20 nm-200 nm)与Exosome的粒径分布吻合,还有流式细胞仪外泌体表面标志物特异蛋白标志物CD63和CD81,结果提示阳性表达率在95%以上。第三,高通量测序检测大鼠血浆外泌体总RNA的表达量,并选出rno-mi-450 b-5p通过PCR验证其在脑脊液和血浆样品中的表达水平,结果表明rno-miR-450 b-5p在两样本中表达趋势相对一致。再通过生物信息学分析表明外泌体rnomiR-450b-5p可能参与脑缺血的发生发展。最后制作ROC显曲线,并计算假手术组与缺血10分钟组大鼠外泌体rno-miR-450 b-5 p的AUC面积为(0.880),而且外泌体rno-miR-450 b-5 p在缺血10分钟与缺血2小时表达有差异。因此外泌体rno-miR-450b-5p对于诊断大鼠TIA具有较高的价值。结论:血浆外泌体rno-miR-450 b-5 p对于诊断大鼠短暂性脑缺血具有较高的价值,可能成为大鼠TIA的生物学标志物及治疗靶点。