生防荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens 2P24分离自山东小麦全蚀病自然衰退土壤,该菌株能产生抗生素2,4-二乙酰基藤黄酚(2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG)、氢氰酸,嗜铁素和蛋白酶,且抑菌谱广,对多种土传病害均有较好的防治效果。本文从根围定殖特点和生防相关功能因子的调控两方面对P. fluorescens2P24的生防机制进行了研究。通过质粒和转座子携带gfp基因两种方法标记2P24,分别获得标记菌株PM-21和PM-g1。对其进行性状、遗传稳定性和荧光定量分析表明,两种标记方法对野生菌株的生长速度,生物膜的形成及抑菌能力均无明显影响;PM-g1中GFP标记的遗传稳定性(100%)显著高于PM-21(78%)。荧光定量分析表明PM-21的荧光强度是PM-g1的3～4倍。通过荧光显微镜观察gfp标记的2P24在小麦根际的定殖特点,发现大多数PM-g1菌体聚集于根组织的凹陷部,根表皮伤口处及细胞间的缝隙中,其种群数量从小麦根基向根尖呈明显减少趋势。由感应蛋白激酶(sensor kinase) GacS 和反应调控蛋白(response regulator) GacA 组成的GacS/GacA 双因子调控系统广泛存在于革兰氏阴性细菌中,调控生防细菌次生代谢物和胞外酶的产生,在荧光假单胞杆菌的生防活性中起着关键的调控作用。应用Tn5转座突变技术,获得1株产嗜铁素过量,同时不产生2,4-DAPG、HCN、蛋白酶、不能形成生物膜(biofilm)的突变菌株PM3390,其表现型与调控基因gacA的突变体表型相似。应用粘性质粒pLAFR5构建2P24基因组文库,以A1,A2为引物通过PCR介导的文库筛选方法,从2P24基因组文库中获得2个含有gacA基因的阳性克隆,将阳性克隆转化Tn5突变菌株PM3390,互补实验表明其能恢复突变菌株的多种缺失表型。进一步将gacA基因亚克隆到3.3kb,对gacA基因进行内部缺失突变,获得gacA缺失突变菌株PM395。PM-395不产生2,4-DAPG、HCN、蛋白酶和信号分子AHLs,且不能形成生物膜(biofilm),通过pRK415携带1.2kb gacA完整的ORF转入PM395中恢复了突变子PM-395的全部缺失性状。同时生测结果表明,gacA-突变菌株与野生型2P24相比,对不同土传病害的生防效果均显著降低,而互补菌株恢复了突变菌株的部分防效。以上结果证实gacA对2P24的次生代谢产物和其它与生防相关的性状,包括生物膜的形成能力,群体密度感应信号分子AHLs的产生有一定的调控作用,并在2P24防治土传病害中起到重要作用。通过遗传操作改造野生gacA基因的起始密码子(TTG→ATG)和核糖体结合位点(GAGG→GGAGG),将无启动子的lacZ作为报告基因连接于野生gacA和经改造gacA′基因的下游形成共转录结构,分别连接在穿梭载体pRK415上。通过质粒携带导入2P24,体外抑菌和温室生测试验表明,两衍生菌株在防效上无明显差异,但均好于野生菌株。<WP=9>HPLC测定野生菌株和工程菌株的2,4-DAPG产量表明,含有gacA′的菌株2P24-A′中2,4-DAPG产量(32.32 mg/L)高于菌株2P24-A(17.68 mg/L),而2工程菌株的2.4-DAPG产量均高于野生菌株(8.47 mg/L),是2P24的2-4倍,说明通过改造gacA的RBS和起始密码子(start codon)能够提高GacA的表达和抗生素2,4-DAPG的产量。进一步通过Tn5随机突变将gacA′-lacZ共转录结构插入2P24的染色体DNA,在含有x-gal的M9平板上挑选显蓝色的突变体250株,通过体外抑菌和根部竞争定殖试验筛选得到10株与野生菌无显著差异的目标菌株,测定其β-半乳糖苷酶活性和2,4-DAPG产量,证实LacZ的活性与gacA的表达量及抗生素的产量是显著正相关关系,进一步生测试验证实突变菌株2P24-A1′的抗生素2,4-二乙酰基藤黄酚的产量是野生菌株的5.9倍。对番茄细菌性青枯的防效显著高于野生菌株(51.6﹪),达71.6﹪。以上结论证明改造gacA基因和增加染色体上gacA的拷贝数是提高野生生防菌株对作物病害防治效果的有效方法。