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研究背景:皮肤黑色素瘤是世界范围内致死性最高的皮肤肿瘤,如何能更好的判断预后,指导治疗从而提高其生存几率是全球的研究热点之一。既往用于判断皮肤黑色素瘤预后的指标主要有性别、年龄、病理分期,Breslow厚度,有无溃疡,有丝分裂率等临床及病理指标等,但仍不能很好地判定皮肤黑色素瘤预后的差别。分子生物标志物在黑色素瘤预后中有着重要的应用价值,其中基因多态性作为黑色素瘤重要的遗传生物标志物,能够为患者的预后和个体化治疗提供重要信息。得益于人类基因组计划(HGP)和人类基因组单体型图计划(Hap Map Project)的完成,以及高通量基因检测技术的完善,研究者已经可以在全基因组水平上进行基因多态性和复杂疾病相关性的分析,即全基因组关联研究(Genome-wide Association Study,GWAS),通过GWAS已经发现众多与黑色素瘤易感性相关的基因多态性位点。然而,GWAS也有不尽如人意的方面,比如GWAS可能会漏掉一些统计学意义不是最显著,然而有着重要生物学功能的基因多态性位点;单点的GWAS很难分析其背后的分子机制等。基于通路的后GWAS数据分析策略在GWAS基础上,整合了信号通路的生物学功能,从而能帮助我们探索这些关键分子在皮肤黑色素瘤发生及进展中所发挥的作用。作为重要的生理信号,钙信号通路几乎广泛地参与正常细胞周期的整个生理过程,包括细胞的生长、增殖、分化、凋亡等;越来越多的研究发现,钙信号通路的重构或异常是癌细胞的一个重要相关特征,甚至可能是其中的中心环节。本研究通过探索钙信号通路基因多态性与皮肤黑色素瘤的预后相关性,可能帮助我们找到该通路中与皮肤黑色素瘤预后相关的关键分子,为黑色素瘤预后模型及个体化治疗提供理论基础。研究目的:1.探讨钙信号通路关键基因的多态性与皮肤黑色素瘤特异性生存期(cutaneous melanoma-specific survival,CMSS)的相关性;2.筛选钙信号通路中潜在与皮肤黑色素瘤预后相关的关键分子标志物;3.初步探讨这些分子标志物在皮肤黑色素瘤预后中发挥作用的分子机制。材料和方法:本研究利用美国德克萨斯大学安德森癌症中心公开发表的美国非西班牙裔欧洲血统人群的皮肤黑色素瘤全基因组关联研究(Genome-wide Association Study,GWAS)数据库作为发现库,提取了钙信号通路中位于常染色体上的167个基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点。利用多因素Cox回归分析和多重检验校正的方法,筛选出其中与皮肤黑色素瘤生存相关的阳性位点。本研究还利用哈佛大学的皮肤黑色素瘤GWAS数据库作为人群验证库,发现库中筛选到的阳性位点在验证库中进行人群验证。此外,研究中还应用多种功能预测网站和工具对通过验证的SNP位点进行功能验证。对于最终筛选出的位点,我们进一步进行了表达数量性状位点(expression quantitative trait loci,e QTL)分析,遗传模型分析、联合分析和分层分析。本研究中还使用ROC曲线及曲线下面积评估加入了基因型的预测模型预测皮肤黑色素瘤预后的能力。结果:1.从美国德克萨斯大学安德森癌症中心的皮肤黑色素瘤GWAS数据库中,我们共提取到了位于167个钙信号传导通路基因上的共计41 377个SNPs。通过单基因座分析,共筛选出与皮肤黑色素瘤相关的1 830个阳性SNPs。其中,位于4个基因(CHRM3,PDE1A,ITPR1及RYR3)的9个SNPs在经过哈佛大学的皮肤黑色素瘤GWAS数据库的人群验证后,仍具有显著的统计学意义(P?0.050)。2.本研究共筛选出位于3个基因的3个SNPs(PDE1A rs6750552 T>C,ITPR1rs6785564 A>G和RYR3 rs2596191 C>A)作为与皮肤黑色素瘤特异性生存相关的独立预测因素,在meta分析中的风险比(hazards ratio,HR)依次为:1.52(95%可信区间=1.19-1.94,P=7.21×10-4),0.49(0.33-0.73,3.94×10-4)和0.67(0.53-0.86,0.0017)。3.本研究发现PDE1A rs6750552 C等位基因与皮肤黑色素瘤的死亡风险增加显著相关,而ITPR1 rs6785564 G和RYR3 rs2596191 A等位基因则与皮肤黑色素瘤的死亡风险降低显著相关(在美国德克萨斯大学安德森癌症中心的皮肤黑色素瘤数据库中,Ptrend值分别为:0.013,0.004和0.016;在哈佛大学数据库中,Ptrend值分别为:0.022,0.040和0.039;两个数据库整合后,Ptrend值分别为:0.007,0.019和0.003)。4.本研究将3个SNPs的保护基因型(PDE1A rs6750552 TT,ITPR1 rs6785564AG+GG和RYR3 rs2596191 CA+AA)组合后分析:保护基因型越多,预后越好(在美国德克萨斯大学安德森癌症中心的皮肤黑色素瘤数据库、哈佛大学数据库以及整合数据库中,Ptrend值分别为:Ptrend<0.001,Ptrend=0.0002和Ptrend<0.0001);相较于拥有0-1个保护基因型的分组,拥有2-3个保护基因型的分组其死亡风险明显降低:在美国德克萨斯大学安德森癌症中心的皮肤黑色素瘤数据库中:HR为0.49(95%可信区间=0.31-0.76,P=0.002);在哈佛大学数据库中,HR为0.48(0.26-0.90,P=0.021);两者整合后HR为0.61(0.43-0.86,P=0.0049)。5.本研究3个标签SNPs均与相应基因m RNA表达水平相关:PDE1A rs2368253 C等位基因(与PDE1A rs6750552 C高度连锁)被发现与PDE1A m RNA表达水平上调相关;ITPR1 rs6785564 G等位基因则与ITPR1 m RNA表达水平下调相关;同样也观察到了RYR3 rs2596191 A与RYR3 m RNA表达水平下调相关。6.我们将保护基因型加入到年龄和性别变量组成新的皮肤黑色素瘤生存预测模型,皮肤黑色素瘤相关的5年生存率预测模型曲线下面积(AUC)从61.25%增加到67.21%,P=5.79×10-4。结论:1.在本研究的MDACC人群中,年龄、性别、肿瘤分期、Breslow厚度、有无溃疡、肿瘤细胞有丝分裂率等临床因素与CMSS密切相关;而在Harvard研究中,仅有年龄与CMSS密切相关。2.钙信号通路中3个基因多态性位点PDE1A rs6750552 C,ITPR1 rs6785564 G和RYR3 rs2596191 A与皮肤黑色素瘤的预后独立相关。3.PDE1A rs6750552 TT,ITPR1 rs6785564 AG+GG和RYR3 rs2596191 CA+AA为保护基因型,且随着保护基因型数目的增加,皮肤黑色素瘤死亡风险明显降低。4.e QTL结果显示PDE1A rs6750552 C,ITPR1 rs6785564 G和RYR3 rs2596191 A与相应基因的m RNA表达水平相关。5.在预测模型中加入保护基因型这一变量后,该模型预测皮肤黑色素瘤预后的能力显著增加。