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Muraymycin是一个潜在的转位酶抑制因子，在细胞内的靶位点是肽聚糖合成中的转位酶（MraY），因此有较强的抗G+细菌的作用。其抗菌谱窄，有与现有药物不同的靶位点，作用机制独特，目前临床上尚没有MraY抑制剂在使用，所以此类抗生素与现用的抗生素不会产生交叉耐药。因此，muraymycin等尿苷肽类抗生素是寻找新型低毒，窄谱抗菌药物先导化合物的最佳选择。Muraymycin最初发现于2001年，具有相似结构的抗生素有pacidamycin、caprazamycin、sansanmycin、napsamycin等，2011年其生物合成基因簇被克隆得到。本研究从不同水平上对与muraymycin生物合成相关的调控基因mur34、mur33、mur32的功能进行了探索研究。首先，通过PCR-Targeting技术在同源载体上将mur34与mur32进行基因失活。将mur34突变失活后的pJTU5642载体接合转至Streptomyces lividans TK24宿主中后，成功实现了muraymycin基因簇的异源表达。通过对pJTU5030上基因簇边界基因进行失活，确定了抗生素生物合成的最小基因组为mur12到mur33的大片段。染色体基因组上mur34的失活直接导致了菌株发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制活性及muraymycin产量的提高，对突变株进行基因回补后恢复了菌株的野生型表型。利用实时荧光定量PCR检测相对转录情况，发现mur34突变后基因簇的转录提高了30多倍。经测定分析mur33与mur32组成一个操纵子，利用5’RACE技术证实mur33-mur32启动子的转录起始位点位于起始密码子上游58个碱基处。然后，在原核宿主BL21（DE3）中对Mur34进行了His标签融合的蛋白表达，并利用亲和层析技术进行蛋白的制备。通过凝胶迁移试验以及DNase I足迹试验，测定了Mur34与muraymycin基因簇上各启动子DNA的体外结合活性，发现Mur34特异性的结合在mur33起始密码子与转录起始位点中间区域，暗示了Mur34通过阻止RNA聚合酶复合物的迁移而抑制mur33-mur32操纵子的转录。利用儿茶酚-2,3-双加氧酶活性对野生型及突变型启动子的活性进行检测，再次证实Mur34对mur33-mur32的转录抑制作用，同时确定了-10区相对于-35区对启动子发挥功能的重要性。另外，对mur32突变株进行发酵液的抑菌活性、LC-MS以及荧光定量PCR检测等试验，确定mur32的突变对muraymycin的生物合成几乎没有影响。经信息学分析发现，Mur33与SsaA的C端DNA结合域有较高的相似性，是一个调控因子。利用高保真PCR技术扩增mur33核酸序列的左右同源臂，经酶切后连至pOJ446载体上，构建成基因的同框缺失载体pJTU5020，将其通过属间接合转移转至muraymycin野生型产生菌S.sp.NRRL30471，经过染色体同源双交换后获得mur33在染色体上的同框缺失突变。对Mur33突变株的发酵液进行抑菌活性和LC-MS检测分析，发现mur33突变后菌株对枯草芽孢杆菌的抑制活性降低，几乎失去了muraymycin的产生能力。利用实时荧光定量PCR技术检测发现，mur33突变后基因簇的转录水平大幅度降低。另外，对mur33突变株进行基因回补后恢复了菌株的野生型表型。构建mur33的NusA融合蛋白载体，并用自诱导型培养基ZYM5052对蛋白表达菌株进行发酵培养，成功获得了Mur33的可溶性表达。同时设置2个负对照（NusA标签和空载菌株蛋白），以及非特异性poly dI-dC和竞争性探针，对Mur33融合蛋白与启动子DNA的体外结合活性进行检测，发现其与mur12-mur31启动子DNA有较高的结合活性，而muraymycin生物合成相关结构基因的表达都受控于mur12-mur31启动子。因此，确定Mur33作为关键的正调控因子激活muraymycin的生物合成。综上，在muraymycin生物合成的途经特异性调控网络中，Mur34接受上游调控因子传来的信号，通过阻止必需的正调控因子Mur33的转录表达，对muraymycin的生物合成起到抑制作用。本研究工作打开了muraymycin作为新型核苷类（尤其是尿苷类）抗生素生物合成调控研究的大门，为后期进行muraymycin抗生素产量的提高研究以及定向的途经改造指明了方向。