论文部分内容阅读
研究目的动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种常见于大中型动脉血管壁的长期炎症性疾病,是急性和慢性冠状动脉综合征以及缺血性中风等心血管疾病的主要原因。抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome,APS）是一种系统性的自身免疫疾病,其特征为抗-β2-糖蛋白I抗体（anti-β2-glycoprotein I antibody,anti-β2GPI）阳性和反复动静脉血栓形成。APS病人中的anti-β2GPI及其自身抗原β2GPI被认为与AS的病程发展相关。越来越多的研究表明,AS斑块的形成不仅取决于脂质堆积、炎症以及自身免疫性因素,也涉及一些关键的细胞内途径失调。自噬是真核生物将细胞质成分包裹在双膜囊泡内并运送至溶酶体进行分解代谢的过程,具有自我修复和维持稳态的作用。有文献报道,细胞自噬缺陷与AS的发病机制相关,维持正常的自噬水平能够改善内皮细胞功能和加速巨噬细胞脂质代谢,对AS具有保护作用。血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VECs）损伤是AS发展的起始环节,它可以通过释放各种活性分子参与AS全程。本组在前期研究中发现氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox LDL）/β2GPI/anti-β2GPI复合物（ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI complex）,作为一种免疫复合物,可以在AS小鼠模型中促进腹腔巨噬细胞的泡沫化,在体外实验中诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的活化。但是,ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物对VECs自噬的影响尚不清楚。本论文选用人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）和小鼠脑微血管内皮细胞株（brain-derived endothelial cells.3,b End.3）作为体外VECs模型,探究ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物对VECs自噬的作用及其机制,并对自噬改变与VECs功能障碍的关系进行探讨。研究方法（1）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物是否可以影响VECs自噬:利用DMEM（含10%FBS）、ox LDL、ox LDL/β2GPI、ox LDL/anti-β2GPI、β2GPI/anti-β2GPI和ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI分别刺激HUVEC和b End.3细胞,以DMEM（含10%FBS）处理组作为空白对照组。Western blot检测细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3B-Ⅱ和p62的表达水平。m RFP-GFP-LC3串联荧光构建体法检测细胞内的自噬体（autophagosome）和自噬溶酶体（autolysosome）水平,激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope,CLSM）观察实验结果。利用DMEM（含10%FBS）和ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI分别刺激HUVEC和b End.3细胞,以DMEM（含10%FBS）处理组作为空白对照组。透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）观察细胞内自噬泡（autophagic vacuole）的水平。（2）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能否影响VECs自噬流:利用DMEM（含10%FBS）和ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI分别刺激经或未经溶酶体抑制剂氯喹（chloroquine,CQ）预处理过的HUVEC和b End.3细胞。Western blot检测细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3B-Ⅱ和p62的表达水平。m RFP-GFP-LC3串联荧光构建体法检测细胞内的自噬体和自噬溶酶体水平,并通过CLSM观察实验结果。（3）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物是否可以诱导VECs中PI3K/AKT/m TOR和e NOS信号通路蛋白的活化:利用DMEM（含10%FBS）和ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI分别刺激HUVEC和b End.3细胞0、5、15、30、45和60 min,以每个时间点的DMEM（含10%FBS）处理组作为对照组。利用AZD5363（AKT特异性小分子阻断剂）预处理验证AKT与e NOS在信号调控网络中的上下游关系。通过Western blot检测细胞中磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-m TOR和p-e NOS的相对表达水平。（4）探究PI3K/AKT/m TOR和e NOS信号通路在ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物抑制VECs自噬过程中的作用:利用DMEM（含10%FBS）和ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI分别刺激经或未经PI3K、AKT、m TOR和e NOS阻断剂（LY294002、AZD5363、Rapamycin、L-NAME）预处理的HUVEC和b End.3细胞。Western blot检测VECs中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ和p62的表达水平。m RFP-GFP-LC3串联荧光构建体法检测细胞内的自噬体和自噬溶酶体水平,并通过CLSM观察实验结果。（5）验证雷帕霉素（Rapamycin）和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）在HUVEC细胞自噬过程中的作用:利用DMEM（含10%FBS）、Rapamycin和3-MA刺激HUVEC细胞,以DMEM（含10%FBS）处理组作为空白对照组。Western blot检测细胞中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ和p62的表达水平。m RFP-GFP-LC3串联荧光构建体法检测细胞内的自噬体和自噬溶酶体水平,并通过CLSM观察实验结果。鉴定在本研究中,Rapamycin对HUVEC细胞自噬的激活作用及3-MA对HUVEC细胞自噬的抑制作用。（6）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物引起的自噬抑制是否与VECs炎症反应有关:利用DMEM（含10%FBS）、ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI、ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI+Rapamycin和3-MA刺激HUVEC细胞,以DMEM（含10%FBS）处理组作为空白对照组。RT-q PCR检测细胞中白细胞介素（interleukin,IL）-1β、IL-6和细胞间黏附分子（intracellular adhesion molecule,ICAM）-1的m RNA水平。ELISA检测细胞培养上清中IL-1β和IL-6的蛋白浓度。Western blot检测细胞中ICAM-1的蛋白表达水平。（7）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物引起的自噬抑制是否与VECs氧化损伤有关:利用DMEM（含10%FBS）、ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI、ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI+Rapamycin和3-MA刺激HUVEC,以DMEM（含10%FBS）处理组作为空白对照组。通过活性氧（reactive oxygen species,ROS）荧光探针染色试剂检测细胞内ROS的产生。通过超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）检测试剂测定细胞中的SOD活性。（8）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物引起的自噬抑制是否与VECs凋亡有关:利用DMEM（含10%FBS）、ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI、ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI+Rapamycin和3-MA刺激HUVEC,以DMEM（含10%FBS）处理组作为空白对照组。Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率。Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的表达水平。研究结果（1）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能够抑制HUVEC和b End.3的细胞自噬活性利用不同刺激物分组处理HUVEC和b End.3细胞。结果发现,与空白对照组相比,ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物组的细胞中LC3B-ⅠI和Beclin1的蛋白表达水平减少,p62的蛋白积累增加。通过TEM观察HUVEC和b End.3细胞内的自噬泡,发现ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物组的自噬泡数量相比空白对照组明显减少。通过CLSM观察HUVEC和b End.3细胞内自噬体和自噬溶酶体的聚集水平。结果发现,与空白对照组相比,ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物组细胞内自噬体与自噬溶酶体聚集显著减少。（2）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能够在自噬早期抑制HUVEC和b End.3的自噬流利用Western blot检测有或者无CQ的HUVEC和b End.3细胞中自噬相关蛋白LC3B-ⅠI和p62的表达水平,通过CLSM观察细胞内自噬体及自噬溶酶体的聚集水平。结果发现,在未经ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物处理的条件下,CQ预处理明显增加了细胞中LC3B-ⅠI和p62的蛋白表达水平和细胞内自噬体聚集水平。经过ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物处理后,有CQ的细胞中LC3B-ⅠI和p62的蛋白表达水平增加,细胞内自噬体的聚集也增多。然而,在ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物刺激条件下,细胞内LC3B-ⅠI的蛋白表达水平和自噬体聚集水平在有CQ的两组间差异要小于没有添加CQ的两组。（3）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能够诱导HUVEC和b End.3信号通路蛋白PI3K、AKT、m TOR和e NOS的活化利用Western blot检测HUVEC和b End.3细胞中磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-m TOR和p-e NOS的表达水平。结果显示,与0 h相比,经ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物处理后,细胞内磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-m TOR和p-e NOS的相对表达水平均有明显增加。此外,AZD5363预处理能够显著降低由ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物诱导的e NOS相对磷酸化水平的升高。（4）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物引起的HUVEC和b End.3自噬抑制与PI3K/AKT/m TOR和e NOS信号通路有关利用Western blot检测PI3K、AKT、m TOR和e NOS信号分子阻断前后HUVEC和b End.3细胞中自噬相关蛋白LC3B-ⅠI和p62的表达水平,通过CLSM观察细胞内自噬体及自噬溶酶体的水平。结果显示,与单独的ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物组相比,PI3K、AKT、m TOR和e NOS的小分子抑制剂LY294002、AZD5363、Rapamycin和L-NAME预处理均可以部分逆转ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物诱导的自噬抑制效应,细胞中LC3B-ⅠI的蛋白表达水平增加、p62的蛋白积累减少以及自噬体和自噬溶酶体的聚集增多。（5）Rapamycin激活HUVEC细胞自噬,3-MA抑制HUVEC细胞自噬利用Western blot检测Rapamycin和3-MA加入后HUVEC细胞中自噬相关蛋白LC3B-ⅠI的表达水平,通过CLSM观察细胞内自噬体和自噬溶酶体的水平。结果显示,与空白对照组相比,Rapamycin能够明显提高细胞中自噬体标记蛋白LC3B-ⅠI的表达水平,增加细胞内自噬体和自噬溶酶体聚集,3-MA能够降低细胞中LC3B-ⅠI的蛋白表达水平,减少细胞内自噬体和自噬溶酶体的聚集。（6）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物的引起的自噬抑制能够促进HUVEC炎症反应利用RT-q PCR和ELISA检测HUVEC细胞中炎症分子IL-1β、IL-6,和黏附分子ICAM-1的m RNA和蛋白表达水平。结果显示,与空白对照组相比,ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能够促进细胞中IL-1β、IL-6和ICAM-1的基因和蛋白表达。与ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物组相比,ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI+Rapamycin组的IL-1β、IL-6和ICAM-1的m RNA和蛋白表达水平降低,3-MA组的结果与ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物组无明显差异。（7）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物引起的自噬抑制能够促进HUVEC氧化应激损伤利用荧光显微镜和流式细胞仪检测HUVEC中ROS的产生,利用试剂盒检测HUVEC内SOD活性。结果显示,与空白对照组相比,ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能够引起细胞中ROS产生增多、细胞损伤增加和SOD活性降低。ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI+Rapamycin处理部分逆转了ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物的上述氧化应激效应,3-MA组的结果与ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物组无明显差异。（8）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物引起的自噬抑制能够诱导HUVEC细胞凋亡增加利用流式细胞术和Western blot检测HUVEC中的细胞凋亡率和凋亡相关蛋白Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9的表达水平。结果显示,与空白对照组相比,ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能够引起HUVEC细胞凋亡率上升,凋亡相关蛋白Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9表达水平提高。与ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物组相比,ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI+Rapamycin组的细胞凋亡率下降、凋亡相关蛋白Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9的表达水平降低,3-MA组的结果与ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物组相似。结论（1）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能够在VECs自噬早期阶段抑制自噬体的形成,减少自噬流。（2）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能够通过PI3K/AKT/m TOR和e NOS信号通路抑制VECs的自噬过程。（3）Ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物诱导的自噬抑制促进了VECs功能障碍,包括炎症因子表达水平增加、氧化应激和细胞凋亡。