OCILRP2在小鼠T细胞活化中的共刺激作用及其机制

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背景T淋巴细胞在体内主要介导细胞免疫应答,整个应答过程分为三个阶段:T细胞特异性识别抗原阶段,T细胞活化、增殖和分化阶段,T细胞应答的效应阶段。T细胞共刺激在T细胞活化、增殖、分化和生存中发挥重要作用。共刺激涉及效应淋巴细胞表面配体受体的相互作用。破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2(Osteoclast inhibit lectin related protein2, OCILRP2)基因最初从成骨细胞中分离获得,它高表达于脾脏、胸腺、B淋巴细胞、DC及活化的T细胞中,而静止的T细胞中OCILRP2的表达水平很低。研究表明OCILRP2是小鼠T细胞活化共刺激中的一个重要的活化受体,其配体为NKRP1f。OCILRP2是C型凝集素样受体分子。C型凝集素样受体分子在固有免疫及获得性免疫应答中通过与其配体结合而发挥重要的作用,其家族成员NKG2D缺少细胞质信号传导基序,因而通过与不同的接头蛋白结合激活NK细胞及CD8+T细胞。OCILRP2蛋白胞内段很短,同样缺少细胞质信号传导基序,不能传递信号,所以我们推测OCILRP2可能类似于NKG2D,通过与跨膜接头蛋白DAP12相互作用而活化下游信号通路。研究表明OCILRP2沉默的T细胞中酪氨酸磷酸化的lck减少,活化的T细胞中PI3-K的酪氨酸磷酸化不变。然而OCILRP2共刺激T细胞活化的确切机制及相关的信号转导通路尚不清楚。目的研究OCILRP2在小鼠T细胞活化过程中的共刺激作用及其机制,鉴定与OCILRP2发挥协同作用的接头蛋白,探索其介导T细胞活化的信号通路,丰富T细胞活化的共刺激理论,为深入理解T细胞活化的分子机制提供新线索。方法通过免疫共沉淀、GST pull down、激光共聚焦显微镜CLSM等实验鉴定与OCILRP2相互作用的接头蛋白分子。构建了全长、胞内段、胞外段加跨膜区重组OCILRP2蛋白,用来分析OCILRP2与接头蛋白分子相互作用的区域。CD3/CD28抗体及PMA刺激小鼠T淋巴瘤EL4细胞,检测刺激前后细胞因子的分泌、细胞增殖、凋亡、细胞周期等生物学特征,运用荧光定量PCR技术检测某些转录因子的变化,同时用免疫印迹技术寻找与OCILRP2相关的信号转导通路。结果成功构建了GST-DAP12、GST-OCILRP2胞内段、GST-OCILRP2胞外段加跨膜区的融合蛋白,鉴定出OCILRP2与接头蛋白分子DAP12相互作用,且只有胞外段加跨膜区的重组蛋白可与DAP12蛋白质相互作用,DAP12与Ras不发生相互作用。激光共聚焦结果显示OCILRP2与DAP12在EL4细胞膜上共定位。静止的EL4细胞系中OCILRP2主要在细胞浆中表达,用CD3/CD28抗体激活的EL4细胞,受体由胞内转运到细胞表面,而用PMA处理的EL4细胞没有表现出这种易位现象。DAP12经抗体刺激前后其膜上蛋白表达情况不发生改变。小鼠淋巴瘤细胞EL4在未受到任何刺激的情况下分泌IL-2的水平很低,经CD3/CD28抗体刺激后,EL4分泌IL-2的水平显著升高。并且随着CD3抗体浓度的升高和刺激时间的加长,IL-2的分泌水平也增高,摸索出CD3/CD28抗体刺激EL4细胞的最佳抗体浓度和刺激时间。不同处理组对EL4细胞进行刺激48h,发现加入了OCILRP2抗体组的IL-2的分泌水平有所降低。CD3/CD28抗体浓度增加,对EL4细胞增殖有促进作用,加入OCILRP2抗体组与沉默组EL4增殖情况较CD3/CD28抗体减慢。而加入外源性IL-2抗体并不影响EL4细胞的增殖。OCILRP2不影响EL4细胞的细胞周期。anti-OCILRP2抗体与si-OCILRP2质粒均能使EL4细胞的凋亡情况减少。抗CD3/CD28抗体可明显促进IL-2, NF-κB, NF-AT, MAPK3, MAPK8mRNA合成。OCILRP2沉默使MAPK3和MAPK8的活化减少。结论OCILRP2与DAP12相互作用,通过MAPK通路进行信号转导,从而为T细胞活化提供共刺激信号。
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