背景在进行骨折不连接、骨缺损和脊柱融合术治疗时，采取骨移植的治疗手段是临床上所必需的。而在进行传统治疗后，新骨产生并替代的过程会耗上数月甚至数年，而且治愈后还会常发生再次骨连接不良、发生缺损等后遗症，影响植骨效果。迄今为止，骨移植开始从植骨支架、能够分化成为骨组织的干细胞和参与干细胞成骨分化的细胞因子三方面着手来避免骨移植治疗的失败。目前，植骨支架多使用Ⅰ型胶原，此胶原成海绵状，对改善骨移植效果明显；同时，已经被人们所发现和使用的间充质干细胞使成骨种子细胞问题得以解决，但是由于间充质干细胞能向多种细胞系分化，因此寻找特定的细胞因子能够使间充质干细胞定向分化成为成骨细胞成为目前该领域研究探索的热点。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是存在于结缔组织和多种器官间质中的多功能干细胞，其在特定的刺激下可以分化成为成骨细胞。而TGF-β超家族成员之一骨形态发生蛋白（bonemorphogenetic proteins, BMPs）可以诱导间充质干细胞分化成为成骨细胞，目前至少存在20多种BMPs,并且目前为止，研究发现BMP9的成骨诱导能力是最强的。已有研究表明，BMP9可以通过激活其下游的经典信号通路BMPs-Smad信号通路和一些非经典信号通路（例如MAPK、Wnt、PI3K/AKT）等来诱导间充质干细胞成骨分化，但目前对BMP9的上游调控因子了解甚少。本课题希望通过探讨肿瘤抑制因子p53家族中的p63转录因子对BMP9及其信号的调控进行进一步探索，试图进一步解释BMP9具有很强诱导间充质干细胞成骨的作用机制，为BMP9诱导成骨分化的分子机制提供更深的理论依据。目的（1）p63基因是否与BMP9存在相互联系，p63是否为BMP9的上游调控基因；（2）p63基因在BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化中的作用；（3）p63在BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化中发挥作用可能的作用机制。方法第一部分：首先通过AdEasy系统构建p63的全长亚型TAp63和显性负性突变亚型ΔNp63的重组腺病毒，然后将AdTAp63两种腺病毒分别感染iMefs细胞以及p63-/-的iMefs细胞，通过PCR方法检测在细胞过表达TAp63的情况下BMP9mRNA水平的变化。同时通ChIP的方法检测p63是否是BMP9的上游调控因子，是否与BMP9的转录启动子结合对BMP9的表达进行调控，并且在2周龄的C57小鼠的长骨生长板中检测是否有p63蛋白的表达。第二部分：在体外实验中，首先通过检测早期成骨指标碱性磷酸酶（ALP）活性的变化来验证TAp63是否会促进BMP9诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化。相反，ΔNp63是否会抑制BMP9诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化。然后通过茜素红S染色以及免疫细胞化学的方法检测骨桥蛋白（OPN）和骨钙素（OCN）表达的变化来验证TAp63或者ΔNp63是否会影响BMP9诱导的成骨晚期标志物的表达。随后通过半定量PCR和定量PCR的方法来检测TAp63、ΔNp63对BMP9下游与成骨分化相关基因Osterix和Runx2表达的影响。在体内实验中，先将AdTAp63、AdΔNp63和AdBMP9分别或同时感染iMEFs细胞，然后将细胞收集起来对裸鼠进行皮下和肌肉内注射，一个月后取出包块进行microCT扫描，HE染色、Masson’s Trichrome染色以及Alcianblue染色来检测TAp63、ΔNp63是否对BMP9诱导的骨髓间充质干细胞体内异位成骨分化产生影响。第三部分：通过MTT实验和流式细胞术分析TAp63是否会影响BMP9对间充质干细胞增殖和细胞周期的调控而影响细胞的分化。另一方面，通过免疫细胞化学的方法检测TAp63是否会通过BMP9下游的信号通路及其定位来影响BMP9对间充质干细胞的分化的诱导效果。结果通过第一部分实验的研究发现，p63蛋白在2周大小的C57小鼠长骨生长板的软骨细胞区域有所表达，并且在iMEFs(mouse embryonicfibroblasts, MEFs)细胞过表达TAp63和向p63-/-的MEFs补回p63基因后，发现TAp63能够促进BMP9基因的表达，有趣的是，当细胞过表达BMP9后，TAp63的表达反而下降，这间接说明p63可能为BMP9的上游调控基因，而BMP9的过表达会造成对p63的负反馈调节。同时，通过ChIP Assay，我们发现TAp63可以与BMP9基因的转录启动子结合，这进一步说明p63与BMP9不但存在相互作用，而且p63是BMP9的上游调控基因。通过第二部分实验发现TAp63能够在体外促进BMP9诱导的早期成骨指标碱性磷酸酶（ALP）的活性,同时还能促进晚期成骨指标钙盐的沉积以及骨桥蛋白（OPN）和骨钙素（OCN）表达，协同BMP9诱导间充质干细胞成骨分化。同时，TAp63还能促进BMP9下游成骨相关转录基因Osterix和Runx2的表达。由于ΔNp63是p63的显型负性突变亚型，通过实验证明其作用与TAp63相反，对BMP9的诱导间充质干细胞成骨分化起拮抗作用。在体内实验中，TAp63能够促进BMP9诱导的皮下包块以及肌肉包块的骨组织面积的增大以及骨组织成熟度的增加，而与体外实验一致，ΔNp63的作用相反。这些结果说明, p63可作为BMP9的上游调控基因能够促进BMP9的成骨诱导作用。在第三部分实验中，通过MTT实验，我们发现TAp63抑制BMP9促进的细胞增殖，同时通过流式细胞术检测BMP9诱导的骨髓间充质干细胞分化过程中各组细胞周期的变化，我们发现在细胞同时感染了AdBMP9和AdTAp63后24小时和48小时分别都检测到TAp63能够促进G0/G1期细胞数量的增多，S期细胞数量减少，这提示TAp63对BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的促进作用可能与其能增加G0/G1期细胞的比例抑制细胞增殖促进细胞分化有关。通过免疫细胞化学染色的方法发现TAp63可以促进BMP9的经典信号通路中Smad1/5/8信号分子的磷酸化以及BMP9非经典信号途径p38MAPK和PI3K/Akt中p38、AKT的磷酸化水平，同时TAp63还可以促进Smad1/5/8复合物的核内转移，这些实验结果都说明p63可以通过调节细胞周期以及信号通路中信号分子的活性来调节BMP9诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化。结论综上所述，本课题通过体内和体外实验证明了TAp63作为BMP9的上游调控基因，能够通过调节细胞周期以及细胞信号通路等机制促进BMP9诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化。