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丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoides subsp Mycoides,Mmm)作为牛传染性胸膜肺炎(Contagious Bovine Pleuropneumonia,CBPP)的病原,具有极高传染力。感染牛主要表现为体温升高呈稽留热,呼吸困难等症状,曾给我国造成巨大经济损失。我国虽已消灭CBPP,但该病还在周边国家流行.根据OIE要求,我国每年进行全国范围的血清学监测。竞争性酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA,ciELISA)是全球唯一的检测CBPP商品化试剂盒。因检测样本量大,商品试剂盒昂贵且完全依赖进口,这些因素阻碍了我国对CBPP的防控。因此,研制国产CBPP血清抗体试剂盒具有重大意义。在本研究中根据Mmm的基因组序列利用生物信息学软件对进其行了对比分析,选定5种膜相关脂质蛋白即P35、P42、P46、P47、P50。利用原核表达系统表达这五种蛋白并纯化,然后对其特异性与反应原性进行研究。特异性研究显示重组蛋白P35(rP35)蛋白能明显区分CBPP阳性血清与牛支原体、牛鼻支原体、牛无乳支原体的阳性血清,反应原性研究显示用CBPP阳性血清作为一抗进行Western blot和Dot-blot试验,Dot-blot试验结果为阳性,证明rP35可能是Mmm特有的一种构象依赖性免疫相关蛋白,且具有反应原性。以rP35作为包被抗原,建立了rP35-iELISA方法,分别对包被条件、待检血清反应条件、封闭条件、二抗作用条件、显色条件、cut-off值等反应条件进行择优筛选,确定该方法最佳的反应条件为:包被浓度2.5μg/ml,血清样品稀释度为1:80;最佳作用时间为60min;用5%鱼明胶37℃封闭2h;二抗以1:10000稀释37℃反应30min;显色时间为10min。为了评估rP35-iELISA检测方法的性能,对该方法的敏感性能、特异性能、重复性能、对临床收集的样品用rP35-iELISA检测方法与ciELISA方法同时检测并计算符合率,对该方法进行综合评估。实验结果显示:rP35-iELISA方法敏感性特异性分别是为90%和89%,最大稀释倍数为1:640,与牛支原体等6种牛源性常见病阳性血清不发生交叉反应,重复性试验显示该方法的批内、批间变异系数均小于10%,符合率试验结果显示rP35-iELISA与商品化试剂盒总符合率为82.99%。综上所述该方法具有良好的敏感性、特异性、重复性、符合率,有望为CBPP的诊断提供一种新型的检测工具。