米曲霉（Aspergillus oryzae）是一种广泛应用于传统酿造行业的丝状真菌,主要用于清酒和酱油的生产。因具有分泌各种水解酶（淀粉酶、蛋白酶等）的显著潜力,近年来被广泛用作异源表达的宿主以提高各种水解酶及次级代谢产物的产量。相比之下,米曲霉近亲黄曲霉（Aspergillus flavus）因能分泌黄曲霉毒素而在发酵工业应用中受限。近年来大量研究表明米曲霉和黄曲霉同属黄曲霉亚属,两者的基因组在编码区显示极高的相似性。系统发育分析中,米曲霉源于黄曲霉一个分支的单系分支,并且通过驯化,米曲霉逐渐从黄曲霉中解毒和分化出来。尽管如此,对于拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉不分泌黄曲霉毒素这一现象仍未找到合理的解释。近年来大量的黄曲霉毒素合成调控因子的发现,为研究者探究拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉却不分泌毒素提供了新方向。基于此,米曲霉驯化过程中黄曲霉毒素合成调控基因的演化以及调控基因能否在拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉中发挥功能作用以调控毒素分泌需要更深一步的研究。本文研究内容包括米曲霉和黄曲霉的比较基因组学分析、黄曲霉毒素合成调控基因Stu A和Raf A在米曲霉中的异源表达及其对黄曲霉毒素合成的影响以及异源表达菌株的转录组分析,研究结果如下:1、泛基因组测序的9株米曲霉及黄曲霉菌株与3株参考菌株的基因组一起进行基因组特征比较、基因功能注释、蛋白预测分析以及次级代谢基因簇预测分析。分析发现各菌株基因组中转运蛋白、碳水化合物活性酶以及次级代谢基因簇的数量存在保守性和多样性。系统发育树分析发现不分泌黄曲霉毒素的黄曲霉与米曲霉聚为同一进化枝,这表明不产毒的黄曲霉亲缘关系和米曲霉更近。产毒黄曲霉可能在驯化过程中被人为筛选,得到不产毒黄曲霉,而米曲霉则很可能由不产毒黄曲霉进一步进化而来。因A.oryzae 2351与A.oryzae RIB40聚为同一进化枝,且A.oryzae 2351具有完整的黄曲霉毒素生物合成同源基因簇,因而被选定为后续研究菌株,探究其可能的菌株特性。此外,米曲霉菌株A.oryzae 2351、A.oryzae RIB40,以及黄曲霉A.flavus NRRL3357中编码Stu A和Raf A转录因子的基因的序列比对发现,三个菌株的Stu A和Raf A基因序列有一定的差异（碱基替换或片段缺失）。2、为解释拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉为何不分泌毒素,使用原生质体转化法将敲除载体p Ao G转化至具有完整的黄曲霉毒素生物合成同源基因簇的米曲霉菌株A.oryzae 2351中,获得了营养缺陷型米曲霉2351-Δpyr G纯合菌株。通过酶切和酶连进行的连接转化实验,成功构建了Raf A和Stu A基因异源表达载体。进一步的PEG介导的原生质体转化,获得了异源表达菌株2351-Raf A以及2351-Stu A的阳性转化菌株。3、为探究异源表达菌株的形态以及对氮源的响应,限氮条件下培养各菌株,发现对照菌株与异源表达菌株的菌落并未因氮源浓度变化而发生明显变化,但异源表达菌株的菌落明显大于对照菌株。2351-Δpyr G与异源表达菌株2351-Raf A的分生孢子数量远低于2351-Stu A。这表明黄曲霉毒素合成调控基因Stu A的转入更有利于菌株分生孢子的产生。此外,三个菌株的生物量随氮源浓度的降低而降低,其中2351-Δpyr G的生物量降低最为明显,与对照相比,轻度限氮使得菌株生物量下降一半以上。与对照菌株相比,相同氮源浓度下异源表达菌株的生物量明显降低,2351-Stu A菌株比菌株2351-Raf A的生物量更少,这一结果表明Stu A基因的转入对菌株生物量的影响更大。4、为探究异源表达基因Stu A和Raf A是否能调控具有完整黄曲霉毒素合成基因同源簇的米曲霉菌株分泌黄曲霉毒素的情况,在限氮条件下培养各菌株。黄曲霉毒素测定发现,异源表达米曲霉菌株均能够分泌黄曲霉毒素,其中2351-Stu A菌株黄曲霉毒素分泌量高于菌株2351-Raf A。后续的异源表达菌株侵染植物种子实验中2351-Stu A菌株的侵染能力更强也再次印证了这一结论。此外,异源表达菌株黄曲霉毒素产量与氮源浓度呈负相关,说明这两个调控因子可能响应氮代谢来调控黄曲霉毒素的分泌。5、为进一步探究异源表达菌株毒素分泌的分子机理,对照菌株以及异源表达菌株进行了转录组组学检测。转录组测序鉴定了不同数量的差异表达基因且差异表达分析发现在黄曲霉毒素合成途径中鉴定的差异表达基因的表达量有不同程度的上调或下调。黄曲霉毒素合成途经中鉴定了48个编码黄曲霉毒素合成相关酶的差异表达基因,其中表达量上调的基因编码的酶大多参与合成黄曲霉毒素前体杂色曲霉素以及直接参与黄曲霉毒素的合成。此外,异源表达菌株2351-Stu A中编码黄曲霉毒素合成相关酶的差异表达基因表达量上调个数多于2351-Raf A。GO富集分析表明,差异表达基因主要分布于membrane与membrane part,主要参与代谢过程以及细胞过程,以及主要行使催化和结合等分子功能。KEGG通路富集分析表明三个基因集中差异表达基因分别富集在β-丙氨酸代谢、苯丙胺酸代谢以及α-亚油酸代谢通路。本文在拥有完整黄曲霉毒素合成基因同源簇的米曲霉中转入黄曲霉毒素合成调控基因,发现了调控基因能调控黄曲霉毒素分泌,并通过转录组测序初步探究了相关的调控机理。