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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病。患者的病理特征是中脑黑质区域的多巴胺能神经元(Dopaminergic neuron,DN)出现特异性损伤和死亡,但其病理发生的原因至今不明;一般认为这种损伤和死亡可能与多巴胺(dopamine,DA)的代谢有紧密联系。已知DA极易被氧化形成多巴胺醌(dopamine quinone,DAQ),而DAQ可与蛋白质的巯基结合,形成醌蛋白,造成蛋白质活性下降甚至失活,从而导致细胞毒性。这是否是PD患者DN持续死亡的原因目前众说不一。在前期研究中,我们课题组发现随着年龄增加老龄鼠黑质DN逐渐减少的同时,在老龄大鼠黑质区,乳酸脱氢酶B(Lactate dehydrogenase B,LDHB)、α-烯醇化酶(Enolase 1,ENO1)及苹果酸脱氢酶-1(Malate dehydrogenase-1,MDH1)中DAQ的修饰显著增多;由于这些蛋白质是能量代谢过程中的关键酶,研究它们的醌化是否为DN大量死亡的直接因素,有助于阐明PD的发病机制,为PD发病的有效干预和治疗提供新的思路。首先,我们以人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)作为研究多巴胺能神经元的细胞模型;将一系列浓度梯度的外源性DA与细胞共同孵育后,用MTT法检测细胞的存活率、用NBT法检测细胞内醌蛋白总含量的变化、并用Western-blot法检测上述这些能量代谢关键酶含量的变化。我们发现与对照组(不加DA)相比,随着DA浓度增加,细胞存活率显著下降,同时蛋白中醌含量显著增加;将100 mol/L DA与细胞共孵育24 h后,细胞内LDHB、ENO1和MDH1这三种酶的含量均显著下降,这些结果提示,对于离体培养的细胞,外源性高浓度DA可通过氧化形成DAQ对细胞内蛋白质形成醌化修饰,这种修饰也造成上述三种能量代谢关键酶的含量下降。其次,我们运用RNAi的方法分别将细胞内的LDHB、ENO1及MDH1的酶表达量敲低,模拟这些酶被DAQ修饰后活性下调的细胞状态,了解这些酶的下调与细胞存活率的相关性及其影响存活率的可能途径。实验中我们分别对细胞的存活率、ATP含量、线粒体膜电位及NADPH/NADP~+比值的变化进行检测。结果发现,当这些关键酶的表达量在细胞内下调的时候,细胞的存活率、ATP含量、线粒体膜电位及NADPH/NADP~+比值均下降,且与对照组(未RNAi的细胞)相比具有显著性差异。我们接着用一定浓度的DA和L-DOPA(DA前体物质)处理这些关键酶下调的细胞,发现这些细胞更易受到DA及L-DOPA的毒性影响,细胞存活率较正常细胞显著降低,这提示我们,细胞一旦受损,将更易受DA毒性的影响而引起恶性循环。综上研究结果显示,DA的氧化产物DAQ存在对LDHB、ENO1和MDH1造成醌化后修饰的现象,使得这些酶的活性下降,以致最终造成细胞毒性。通过进一步研究发现,这些酶的下调表达与细胞内线粒体膜电位、ATP含量和NADPH/NADP~+比例下降有正相关;这些结果提示细胞能量代谢途径受阻以及细胞出现氧化损伤可能是DA毒性的主要细胞致死途径,一旦DA引起细胞损伤,细胞更易受DA代谢紊乱的毒性影响,形成恶性循环,引起DN死亡。本研究为DA代谢紊乱导致DN死亡的机制提供了新的线索,对PD的治疗策略提供了有参考价值的实验依据。