第一部分栀子蓝染色剂对晶状体前囊膜的染色效果及眼前节安全性检测目的:探讨栀子蓝染色剂对晶体前囊膜染色的效果以及最佳染色浓度;与台盼蓝比较染色前囊膜后眼压、角膜及前房的变化。材料与方法:选用健康无眼病新西兰白兔18只,按不同浓度的栀子蓝染色剂(5%、4%、3%、2%、1%、0.5%浓度)随机分为6组,对兔晶体前囊膜进行染色,观察染色效果,采用连续环形撕囊术取出染色的前囊膜,确定最佳染色剂浓度。再选取健康无眼病新西兰白兔27只,随机抽签法分为3组:栀子蓝染色剂组;bio-blue阳性药组;生理盐水组,右眼为实验眼。分别检测1D、7D、14D兔眼压、前房炎症、角膜内皮损伤情况、前房角病理变化。用茜素红-台盼蓝染色法检测角膜内皮的损伤情况,并对剩余组织固定、包埋、冷冻、制备切片、HE染色,利用荧光显微镜观察前房角病理变化。结果:1.栀子蓝染色剂可有效着染晶状体前囊膜,且染色剂浓度为2%、染色30s时染色效果最佳。2.栀子蓝染色剂组、bio-blue阳性药组、生理盐水组分别检测1D、7D、14D眼压,各组眼压没有明显差异,P=0.205(大于0.05)不具有统计学意义,同时裂隙灯检测各组实验动物前房变化,各组实验动物角膜厚度均匀,前房深浅均匀,未见水肿、炎症、前房闪辉等症状。3.角膜内皮茜素红-台盼蓝染色显示角膜内皮形态完整,无水肿、无蓝色着色,角膜内皮无明显损伤情况,HE染色后前房角未见明显炎症反应。结论:1.栀子蓝染色剂可有效着染晶状体前囊膜,且前房注射后不会引起眼压升高及角膜水肿、前房炎症等症状。2.染色剂对角膜内皮无损伤,前房角未见明显炎症反应且染色剂不会引起前房角炎症等病理变化。第二部分 栀子蓝染色剂对大鼠视网膜的毒性检测目的:玻璃体腔内注射栀子蓝染色剂后,观察其对视网膜是否产生毒副作用。材料与方法:选择健康无眼病SD大鼠36只,随机分成4组:生理盐水组;bio-blue前囊膜染色剂组;栀子蓝色素组;N-甲基-D-天冬氨酸阴性对照组,右眼作为实验眼,向每组实验动物玻璃体腔内注射相应试剂。分别于1D、7D、14D处死3只实验动物,立即取材,固定、包埋、冷冻过夜、制备冰冻切片,搜集视乳头附近组织进行HE染色与TUNEL凋亡染色,检测染色剂对死亡视网膜的毒副作用。结果:1.栀子蓝染色剂组、生理盐水组、bio-blue前囊膜染色剂组,视网膜内核层、外核层、视神经节细胞形态完整、没见明显的细胞损伤情况,N-甲基-D-天冬氨酸组可见神经节细胞形态完整,内核层细胞轻度溶解,内核层变薄,外核层可见散在的细胞核固缩现象,对视网膜具有一定的损伤。2.栀子蓝染色剂组、生理盐水组、bio-blue前囊膜染色剂组可见细胞形态完整,无红色着色细胞,视网膜层未见凋亡细胞,N-甲基-D-天冬氨酸实验组可见7D、14D存在外合成散在红色着色细胞,外合成细胞散在凋亡。结论:栀子蓝染色剂对视网膜细胞无明显损伤情况且视神经层无凋亡细胞。初步断定栀子蓝色素对视网膜无毒副作用。第三部分栀子蓝对晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用目的:探究栀子蓝对氧化损伤的晶状体上皮细胞是否具有保护作用。材料与方法:主要仪器与试剂:人晶状体上皮细胞株SRA01/04(美国ATCC细胞库),栀子蓝染色剂(99%)(陕西亿康龙生物技术有限公司),胎牛血清、DMEM高糖培养基(德国BI公司),胰酶(美国Gibico公司),MTT试剂(美国Sigma公司),电子天平FA1204B(河南兄弟仪器设备有限公司),酶标测定仪(Biotek Gen5),低温台式离心机(德国西门子公司),倒置相差荧光显微镜(日本尼康公司),细胞计数器、细胞计数板(无锡德凡仪器有限公司)。方法:为确定后续实验中使用H2O2的最佳浓度,分别用 100 μ mol/L,200 μ mol/L,400 μ mol/L,800 μ mol/L 四种浓度的 H2O2 分别对晶状体上皮细胞作用24小时,检测晶状体上皮细胞存活率。在探究栀子蓝对SRA氧化损伤保护作用实验中,先使用浓度为10 μ mol/L,30μmol/L,50μmol/L,100 μ mol/L的栀子蓝溶液对晶状体上皮细胞作用1小时后,加入H2O2继续培养24小时使SRA细胞发生氧化损伤,通过MTT比色法检测栀子蓝对SRA细胞氧化损伤的保护作用。结果:1.SRA细胞存活率随着H2O2浓度的升高而降低,后续实验选用H2O2浓度为200 μ mol/L。2.MTT比色法检测结果显示:氧化损伤组SRA细胞经H2O2作用后,SRA细胞存活率(49.85±6.49)%,明显低于细胞对照组(99.55±3.78)%,且差异有统计学意义(P<0.001)。使用栀子蓝溶液预处理1h后,经H2O2作用的SRA细胞存活率均有提高,10 μ g/mL栀子蓝组SRA细胞存活率(55.80±2.87)%;30μg/mL栀子蓝组SRA细胞存活率(60.11 ±2.43)%;50 μ g/mL栀子蓝组SRA细胞存活率(64.28±2.26)%;100 μ g/mL栀子蓝组SRA细胞存活率(61.97±2.61)%。与氧化损伤组比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论:1.SRA细胞存活率随着H2O2浓度的升高而降低,SRA细胞氧化损伤造模选用H2O2浓度200μ mol/L。2.栀子蓝溶液对SRA细胞氧化损伤具有保护作用。