诱导多能干细胞技术主要涉及两个方面,一方面是利用外源特定转录因子导入受体细胞,激活受体细胞的内源基因表达,改变相关的表观遗传印记,使细胞处于一种不稳定的中间活化状态；另一方面是通过特定的培养条件,将处于中间活化状态的细胞向特定方向进行诱导和筛选,根据所提供的多能干细胞特定培养条件,筛选出与胚胎干细胞相类似的诱导型多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。目前猪诱导型多能干细胞(piPSCs)不同细胞系之间差异较大,特征难以统一,所得到的大部分piPSCs细胞系均未能实现外源基因的沉默,虽然有报道piPSCs可以进行嵌合体实验,至今却没有得到其他实验室的重复,更令人奇怪的是piPSCs的核移植胚胎发育率远远低于正常的体细胞,并且克隆胚胎的体内发育率更是极低,不能达到小鼠iPSCs细胞的多能性水平,这也使piPSCs细胞在转基因猪生产和建立疾病模型方面的应用受到限制。此外,猪胚胎干细胞的研究进展缓慢,没有公认的猪胚胎干细胞及合适的培养系统作为参考,且猪发育生物学上研究的不充分,使得piPSCs在体外的多能性维持较为困难。基于诱导多能干细胞技术特点和piPSCs目前存在的问题,本研究在piPSCs的体外培养因素和多能性状态两个方面进行了研究,主要内容如下：1、两种来源piPSCs产生效率和体外增殖能力的影响因素研究(1)采用3因子、4因子和6因子组合的Tet-on诱导调控系统慢病毒对巴马小型猪成纤维细胞和骨髓间充质干细胞进行重编程,对诱导产生的两种piPSCs进行形态学、碱性磷酸酶染色、免疫荧光、基因表达、核型分析、体外和体内分化能力检测,结果表明,两种来源猪细胞产生piPSCs的效率相同,诱导产生的两种piPSCs均具有类似胚胎干细胞的特征。比较了3种方法对piPSCs产生效率的影响,三因子诱导产生的克隆经碱性磷酸酶检测为阴性,六因子比四因子诱导效率高,但差异不显著,经基因检测发现,获得的所有克隆外源基因没有沉默。(2)比较了不同饲养层下猪成纤维细胞／骨髓间充质干细胞来源iPSCs生长情况,猪成纤维细胞／骨髓间充质干细胞来源iPSCs在CF1上生长情况最好,可传20代以上,克隆形成能力最强,平均倍增时间最短,MEF和猪成纤维饲养层次之,二者差异不显著(P>0.05),猪成纤维细胞／骨髓间充质干细胞来源iPSCs在STO饲养层上生长情况最差,表明猪iPSCs不适宜用STO饲养层进行培养。(3)比较了单细胞传代、小克隆传代和中等大小克隆传代对piPSCs体外增殖的影响。结果发现猪成纤维细胞／骨髓间充质干细胞来源iPSCs均不适合单细胞传代,消化成单细胞传代的克隆形成率极低,很少有克隆形成。消化成小克隆和中等大小克隆的传代方式比较,二者克隆形成能力和平均倍增时间相近,克隆团紧凑,未出现分化现象,可传20代以上。(4)研究了ROCK信号通路抑制剂Y-27632对猪成纤维细胞/骨髓间充质干细胞来源iPSCs冻存后解冻复苏效果的影响,结果发现Y-27632能够有效地提高两种猪iPSCs细胞的冻存活率,减少复苏后细胞的死亡数量,并能促进猪iPSCs细胞在传代后的贴壁和克隆形成,但较高浓度的Y-27632会影响猪iPSCs细胞的克隆形态。(5)制备和纯化了细胞周期相关蛋白CDK2和CDC25b,比较CDK2和CDC25b重组蛋白对猪iPSCs克隆形成率和平均倍增时间的影响。结果表明,添加CDK2和(?)CDC25b重组蛋白提高了猪成纤维细胞/骨髓间充质干细胞来源iPSCs克隆形成率,缩短了iPSCs平均倍增时间,其中CDC25b重组蛋白效果最佳。2、两种状态piPSCs的生物学特性和分子调控机制研究(1)巴马小型猪骨髓间充质干细胞诱导产生的多能干细胞(piPB4-6_h)按常规方式进行传代培养,piPB4-6_h呈相对松散、扁平状集落,集落内细胞界限隐约可见。通过改变培养液和饲养层进行传代培养,得到小鼠ES细胞样猪iPSCs(piPB4-6_m)细胞,可以稳定传代20以上。piPB4-6_m集落与piPB4-6_h的明显不同,细胞个体小,piPB4-6_m在体外培养时呈集落状生长,细胞集落有明显的边界,细胞间紧密堆积,无明显的细胞界限。(2)撤除DOX后piPB4-6_m仍可以进行正常的传代培养,仅有少量的piPB4-6_m克隆出现分化现象,结果证明在转化培养条件下,DOX不是必须的。转化培养后单位面积piPB4-6_m克隆显著增多,细胞活性明显高于常规方式培养的piPB4-6_h。(3) piPB4-6_m各项鉴定指标均达到多能干细胞的标准,但piPB4-6_m细胞表达SSEA1,与piPB4-6_h细胞不同。piPB4-6_m和piPB4-6_h的外源Oct4和Sox2基因表达都没有被沉默,而在外源Sox2的表达模式上差异很大,piPB4-6_m细胞的外源Sox2的表达水平高于piPB4-6_h。在内源基因启动方面,虽然内源Oct4、Sox2和Nanog的表达量都有所提高,但是相对外源基因的表达量来讲非常低,在内源Sox2和Nanog的表达上,piPB4-6_h细胞的表达量更高。(4)对两种状态的piPSCs细胞进行X染色体状态的分析,荧光定量PCR检测Xist基因(Xist34和Xist45)和SSEA4基因在piPB4-6_m和piPB4-6_h细胞中的表达,结果表明,piPB4-6_m的Xist基因和SSEA4基因表达量降低,证明转化培养的piPB4-6_m细胞趋近于小鼠的ES细胞状态。(5)通过对两种状态的piPSCs细胞信号通路相关基因的表达分析表明,piPB4-6_m细胞更倾向于LIF和BMP4的信号通路维持,但是也有FGF2的高表达,而piPB4-6_h更倾向bFGF通路；检测了两种状态的piPSCs细胞DLK-DIO3印记区间三个基因DLK1、GTL2和D103的表达,结果表明piPB4-6_m的DLK1、GTL2基因表达显著高于piPB4-6_h,推测piPB4-6_m可能具有更高的多能性水平。