玉米杂种优势相关基因的克隆与功能分析

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杂种优势是生物界普遍存在的生物学现象,已被广泛应用到育种生产实践中。玉米是世界最主要的粮食作物,也是利用杂种优势最早最成功的作物之一。最近几十年,来自世界各国不同的科学家们对杂种优势机理从理论和实验方面做了大量研究,虽然取得了一些进展,并提出了一些经典假说。但杂种优势产生的机理仍然是一个未解之谜,还有许多问题需要深入探讨研究。本研究以玉米新品种吉大101为材料,利用cDNA-AFLP技术,分析了杂交种及其亲本苗期的根、叶片以及授粉后15天幼胚的基因表达差异,取幼苗期根、叶片及授粉后15天的幼胚,提取总RNA,反转录将其反转录合成cDNA后进行AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)分析。选择PstI/MseI和EcoRI/MseI两对酶切组合对双链cDNA进行限制性酶切,得到的粘性末端分别连接对应的人工接头,预扩增后再用240对选择性引物进行选择性扩增,最后通过4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异表达基因。实验共回收了458条差异表达片段,其中根、叶片和幼胚中分别为180、170和108条,对这些差异表达片段进行重复PCR并测序,三个器官中分别成功测序174、156和102条TDF。通过MaizeGDB数据库比对分析,在根、叶片和幼胚中,能找到同源序列的功能片段分别有107、107和90条。分别对这些有功能序列进行Blast2GO功能聚类分析,发现其中大部分基因片段参与物质、能量代谢、抗逆生理活动、植物生长发育、激素合成、转录、细胞周期、物质运输以及信号转导途径等,初步推测这些差异表达基因可能在杂种优势形成过程中发挥关键作用。通过qRT-PCR对部分回收的差异表达片段进行可靠性分析,证实其与cDNA-AFLP实验结果基本一致,表明cDNA-AFLP在分离差异表达基因所得结果具有可信度和可参考性。结合cDNA-AFLP和qRT-PCR实验结果,依据相同基因在不同材料中表达量的高低,对各差异表达基因进行表达模式的分析,结果可总结为以下几种:双亲共沉默表达类型、单亲沉默表达类型、单亲显性表达类型、杂交种特异表达类型及双亲显性表达类型;其中基因单亲显性表达类型和杂交种特异表达类型在本次实验结果中占有较大比例。参照功能聚类分析及qRT-PCR实验结果,从幼苗期根部和授粉后15天幼胚中选取并克隆了7个差异表达基因:基因MPAO和ZmPUB编码促进植物生长发育、抗病和抗衰老相关蛋白(G-74: polyamine oxidase4, P-3: RING/U-boxsuperfamily protein);基因ZmRanGTP1编码促进植物主根生长、抑制侧根生长相关的蛋白(G-81: RAN GTPase activating protein1);基因ZmSEC-14p编码促进植物根毛生长以及具有抗冷功能的蛋白(G-125: Sec14p-likephosphatidylinositol transfer family protein);基因ZmSCP和WD40编码控制灌浆程度、谷粒宽度、胚发育以及植物形态构建等调节种子大小相关的蛋白(P-6:serine carboxypeptidase-like33, P-15: transducin family protein/WD-40repeat familyprotein)以及基因ZmERD15编码干旱诱导脱水蛋白(P-66: dehydration-inducedprotein-ERD15)。初步推测这些基因在杂种优势形成过程中扮演重要角色,现在正在进行功能验证,已侵染拟南芥并获得T1代种子。综上所述,本文应用cDNA-AFLP技术研究了玉米杂交种与其亲本在苗期根、叶片以及授粉后15天幼胚中基因的差异表达,所得到的差异表达基因经过进一步分析及功能验证,对探索杂种优势形成的分子机制具有重要的理论及实践意义。
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