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PGF2α(PGE2是广泛存在于生物体的既具有生殖生理活性又是炎症介质的前列腺素(Prostaglandins,PGs)类化合物中最具有代表性的物质。有研究发现PGF2αPGE2在人子宫内膜修复过程中发挥重要作用。本实验室以往的研究也证实:无论是在体外培养的奶牛子宫内膜上皮细胞还是奶牛子宫内膜组织,PGF2α和PGE2所介导的信号通路都可以促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和白细胞介素 8(interleukin-8,IL-8)等组织修复相关因子的表达。任何损伤的组织器官要恢复正常都要经历复杂的过程,同样子宫内膜组织由炎症恢复正常也要经历这一过程,而在这个过程中子宫内膜上皮细胞的增殖是必不可少的环节。本研究就是基于以上课题背景提出如下问题:PGF2α和PGE2所介导的信号通路是通过何种机制来影响奶牛子宫内膜上皮细胞增殖过程的?具体的研究内容如下:1、奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养以及PGF2α受体(PTGFR)和PGE2受体(PTGER)的相对表达量检测。为了更高效地获得奶牛子宫内膜上皮细胞,本研究对本实验室以前建立的细胞培养方法进行了进一步优化。采用细胞形态观察、免疫荧光染色和细胞实时检测技术(RTCA)对获得细胞进行了全面的评价,采用实时荧光定量PCR检测了奶牛子宫内膜上皮细胞PTGFR和PTGER mRNA的相对表达量。结果显示:与PTGER1、PTGER3和PTGER4相比较,PTGFR mRNA的相对表达量最高,PTGER2 mRNA的相对表达量次之。2、PGF2α-PTGFR途径对奶牛子宫内膜上皮细胞增殖调控机制的研究。首先,采用RTCA和WST-1技术检测了不同浓度的PGF2α和Fluprostenol对奶牛子宫内膜上皮细胞增殖的影响,结果显示:10-6M的PGF2α和Fluprostenol可以极显著地促进奶牛子宫内膜上皮细胞增殖。为了进一步证实PGF2α和Fluprostenol是否通过它们的特异性受体PTGFR来实现促进细胞增殖的作用,采用RTCA和WST-1技术检测了PTGFR的特异性受体拮抗剂AL8810对PGF2α和Fluprostenol促进细胞增殖作用的影响,结果显示:10-5M的AL8810对奶牛子宫内膜上皮细胞的增殖有一定的抑制作用。随后RTCA和WST-1技术检测结果显示:当AL8810存在时,PGF2α和Fluprostenol促进奶牛子宫内膜上皮细胞增殖的作用被极显著地抑制,这就充分说明PGF2α-PTGFR途径是调控奶牛子宫内膜上皮细胞增殖的重要通路之一。采用实时荧光定量PCR和Western blot检测了 PGF2α-PTGFR途径对细胞核增殖抗原(PCNA)表达的影响,结果显示:PGF2α和Fluprostenol都可以显著地促进PCNA的表达。采用实时荧光定量PCR和Western blot检测了PGF2α-PTGFR途径对细胞周期网络系统(Cyclins-CDKs-CKIs)中关键蛋白表达的影响,结果显示:PGF2α-PTGFR途径可以显著上调细胞周期蛋白A、B1、D1、D2、D3、E2(CyclinA、B1、D1、D2、D3、E2)和细胞周期蛋白依赖性激酶1、2、4、6(CDK1、2、4、6)的表达,并且可以下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKIs)p15和p21 mRNA的表达。采用实时荧光定量PCR和Western blot检测了表皮细胞生长因子EGF和PTGFR的表达情况,结果显示:PGF2α-PTGFR途径可以显著上调EGF和PTGFR的表达。最后,本研究又从正反两方面研究了COX-1和COX-2与奶牛子宫内膜上皮细胞增殖的相关性,实时荧光定量PCR和Western blot结果显示:PGF2α-PTGFR途径可以显著促进COX-1和COX-2的表达。RTCA和WST-1技术的结果显示:COX的抑制剂Indomethacin和Aspirin可以显著抑制奶牛子宫内膜上皮细胞的增殖。从而说明由COX-1和COX-2合成的内源性PGs在奶牛子宫内膜上皮细胞的增殖过程中发挥重要调节作用。3、PGE2-PTGER2途径对奶牛子宫内膜上皮细胞增殖调控机制的研究。首先,检测了不同浓度的PGE2和Butaprost对奶牛子宫内膜上皮细胞增殖的影响,结果显示:10-6M的PGE2和Butaprost可以极显著地促进奶牛子宫内膜上皮细胞的增殖。当PTGER2的特异性受体拮抗剂AH6809存在时,PGE2和Butaprost促进奶牛子宫内膜上皮细胞增殖的作用被极显著地抑制,这就充分说明PGE2-PTGER2途径是调控奶牛子宫内膜上皮细胞增殖的另一重要通路。实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示:PGE2-PTGER2途径可以显著促进PCNA、Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3、Cyclin E2、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、EGF、COX-1、COX-2和PTGER2的表达。全文结论:无论PGF2α-PTGFR途径还是PGE2-PTGER2途径都可以显著促进奶牛子宫内膜上皮细胞的增殖;PGF2α-PTGFR和PGE2-PTGER2途径都可以通过调节Cyclins、CDKs、CKIs、PCNA、EGF、COX-1和COX-2 的表达来实现对奶牛子宫内膜上皮细胞增殖过程的调控;PGF2α-PTGFR和PGE2-PTGER2途径可以通过分别上调相对应特异性受体PTGFR和PTGER2的表达以促进奶牛子宫内膜上皮细胞的增殖。