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目的通过基因干预手段调节肝细胞LO2中CISH的表达,探讨CISH对肝细胞LO2炎性因子表达的调控及可能机制。方法1、构建CISH重组过表达质粒并上调肝细胞LO2中CISH的表达模板CISH质粒购于上海吉凯基因科技有限公司;设计引物扩增CISH目的片段;采用Xho I/Kpn I酶切法,将目的基因PCR扩增产物和空质粒GV230重组构成CISH重组过表达质粒;用构建好的CISH重组过表达质粒借助lipo 2000转染肝细胞LO2;采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法Western Blot分别检测肝细胞LO2中CISH在m RNA和蛋白水平的变化。2、合成CISH si RNA并下调肝细胞LO2中CISH的表达CISH si RNA(#1、#2、#3)三条序列购于广州锐博生物技术有限公司,将CISH si RNA(#1、#2、#3)借助lipo 2000转染肝细胞LO2;采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法Western Blot分别检测肝细胞LO2中CISH在m RNA和蛋白水平的变化。3、检测CISH表达变化对肝细胞LO2炎症因子表达的影响CISH重组过表达质粒和CISH si RNA转染肝细胞LO2 48h后,利用ELISA法检测LO2肝细胞培养上清液中炎症因子TNF-α、IL-1β的含量。4、检测CISH表达变化后,肝细胞LO2中信号分子STAT5a的变化CISH重组过表达质粒和CISH si RNA转染肝细胞LO2 48h后,蛋白质印迹法Western Blot检测肝细胞LO2中信号分子STAT5a的表达变化。结果1、成功构建CISH重组过表达质粒CISH重组过表达质粒经菌落PCR鉴定及序列测定证实,扩增出的CISH基因片段与基因数据库中的序列一致,转染人正常肝细胞LO2中能够表达,表明CISH重组过表达质粒构建成功。2、成功构建CISH上、下调肝细胞模型实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法Western Blot检测表明,与阴性对照组相比,转染CISH重组过表达质粒的实验组1可上调CISH的表达,而转染CISH si RNA的实验组2可下调CISH的表达,这表明我们成功构建了CISH上、下调的肝细胞模型。3、CISH表达改变后影响肝细胞LO2分泌炎症因子TNF-α和IL-1βELISA法检测表明,与阴性对照组相比,转染CISH重组过表达质粒的实验组1中的肝细胞LO2细胞分泌的炎症因子TNF-α和IL-1β水平表现出降低趋势,而转染CISH si RNA的实验组2中的肝细胞LO2细胞分泌的炎症因子TNF-α和IL-1β水平则表现出升高趋势。4、CISH上、下调后肝细胞LO2中信号分子STAT5a的表达发生改变蛋白质印迹法Western Blot检测表明,与阴性对照组相比,转染CISH重组过表达质粒的实验组1中的信号分子STAT5a表达量降低,而转染CISH si RNA的实验组2中的信号分子STAT5a表达量则升高。结论1、CISH基因负性调控肝细胞LO2中炎症因子TNF-α和IL-1β的分泌;2、CISH基因可能通过抑制其下游信号分子STAT5a的表达从而影响肝细胞LO2炎症因子的分泌。