论文部分内容阅读
背景:心血管疾病（CVD）是终末期肾病（ESRD）患者常见的并发症和最主要的死亡原因。已经证实尿毒症加速性动脉粥样硬化是最危险的因素。与普通人群相比,尿毒症并发动脉粥样硬化具有发病年龄早、发病率高、病变累积广泛等特点。传统的危险因素如:高血压、糖尿病、血脂代谢紊乱等虽在慢性肾衰病人中也较为普遍,但并不能满意解释尿毒症患者如此高的加速性动脉粥样硬化发病率和死亡率,因此推测,尿毒症患者存在某些特殊致动脉粥样硬化（AS）因子。现已明确AS实质是血管壁细胞的慢性增殖性炎症反应,即致AS危险因子首先导致内皮细胞功能损伤,表现为内皮依赖的舒张功能下降,炎症信号激活和表达炎症细胞因子等。ERSD患者体内严重的代谢紊乱,存在多种毒素,如氧化应激产物、各种终末糖基化产物和各种炎症介质等,它们与内皮细胞相接触,可通过破坏细胞结构和功能直接损伤内皮细胞,同时还可以刺激内皮细胞分泌多种炎症因子、生长因子、粘附分子,诱发持续的微炎症状态。同时,这些活化细胞因子又可以介导炎性细胞的浸润,进一步释放多种炎症因子,从而发挥正反馈效应,使血管内皮细胞的损伤进一步加剧。如此的恶性循环必然导致AS的发生。内质网应激（ERS）作为细胞浆信号网络调节的整合器,可以通过与氧化应激、泛素-蛋白酶体途径（UPP）以及炎症反应等信号途径相偶联,参与心血管疾病、神经系统紊乱、癌症等的发生与发展。从理论上讲,通过调控ERS这一炎症反应的中枢环节的激活对于防治细胞功能损伤有着重要的临床意义。但是,ERS是细胞的自我保护机制,在维持机体的防御功能和细胞死亡平衡方面有着重要的作用,完全阻断又会导致免疫功能缺陷。因此适度的调控ERS,并且有针对性的特异性阻断,可能成为控制尿毒症加速性动脉粥样硬化新思路。近年研究发现,分子伴侣是一种存在于内质网中非常重要的蛋白,具有促进和监控内质网的一些重要功能,如新生多肽链的易位、分泌蛋白的折叠和组装、监控内质网的运作、识别未折叠和错误折叠的蛋白以及定位那些待降解的蛋白以稳定蛋白构象,促进蛋白折叠,调控内质网应激的作用,它的这些特点为我们调节血管内皮细胞ERS的活化,减轻组织细胞损伤提供了理论依据。目的:本课题通过将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与尿毒症血清共培养模拟ERSD内环境来观察经尿毒症血清孵育后细胞增殖能力、ERS活性以及炎症细胞因子的变化规律,探讨ERS信号通路的活化在尿毒症血清致内皮细胞炎症激活中的作用,并分析通过小分子伴侣4-苯基丁酸（4-PBA）干预ERS对血管内皮细胞炎症增殖反应的影响,为临床有效防治尿毒症加速性动脉粥样硬化提供理论依据。方法: 1.将细胞分为正常血清组（H）、尿毒症血清组（U）以及4-PBA干预组（4-PBA）,分别用不同浓度的尿毒症患者血清（2.5%、5%、10%、15%、20%）或正常血清（2.5%、5%、10%、15%、20%）或含有5mM的4-PBA刺激。2.应用HE染色观察HUVECs的形态。3.应用MTT、流式细胞技术检测细胞增殖。4.Hoechst 33342染色检测细胞凋亡。5.应用荧光定量PCR方法检测各组内皮细胞分泌GRP78、MCP-1、NF-κB、P21、VEGF的mRNA表达水平。6.应用ELISA方法检测各组内皮细胞上清液中MCP-1、VEGF的浓度。7.Western blot检测各组内皮细胞GRP78、MCP-1、NF-κB、P21蛋白表达的变化。结果:1.尿毒症血清对细胞增殖能力的影响与同浓度的正常血清组相比,2.5%～10%的尿毒症血清能使细胞吸光度和S期细胞的比例呈浓度依赖性显著上升,细胞P21 mRNA的表达降低（均P<0.05）;随着浓度的继续增加,吸光度和S期细胞的比例逐渐下降,而P21的表达则转向升高,荧光染色发现大量凋亡细胞,提示尿毒症血清在低浓度时（≤10%）呈浓度依赖性促进血管内皮细胞增殖,但是较高浓度（>10%）时促增殖作用减弱,伴随促凋亡作用增强。2.尿毒症血清诱导内皮细胞内质网应激作用与正常血清组相比,2.5%、5%、10%的尿毒症血清刺激内皮细胞24h,GRP78的表达显著增加,且随浓度的增加有进行性升高的趋势,提示ERS在尿毒症血清诱导的HUVECs中显著激活,且其强度随着尿毒症血清浓度的增加进行性增强。3.尿毒症血清对内皮细胞炎症信号激活和炎症因子表达的影响（1）正常血清组:与无血清组相比,10%正常血清刺激HUVECs后可以检测出少量的NF-κB、VEGF和MCP-1,两者相比无明显统计学差异。（2）尿毒症血清组:与正常血清组相比,10%尿毒症血清能使内皮细胞NF-κB、VEGF和MCP-1的mRNA和蛋白表达显著升高（均P<0.05）,提示尿毒症血清引起了血管内皮细胞炎症信号的激活,炎症因子表达上调。4.分子伴侣抑制尿毒症血清刺激细胞内质网应激（1）尿毒症血清组:与正常血清组相比较,尿毒症血清刺激2h、6h、12h均能使内皮细胞GRP78 mRNA的表达上调,GRP78蛋白的表达增加（均P<0.05）,且随时间的延长呈进行性升高趋势。（2）4-PBA干预组:与尿毒症血清组相比较,4-PBA治疗6h后GRP78 mRNA和蛋白的表达显著下降（P<0.05）,治疗12h后进一步降低,与正常血清组相比已无明显差别,提示4-PBA能有效地减轻尿毒症血清引起的ERS。5.分子伴侣抑制尿毒症血清诱导的内皮细胞炎症信号激活及炎症因子的表达（1）尿毒症血清组:与正常血清组相比较,在第2、6、12h末,尿毒症血清组NF-κB、MCP-1和VEGF的表达均显著升高（均P<0.05）,且随时间的延长呈进行性升高趋势。（2）4-PBA干预组:与尿毒症血清组相比较,4-PBA治疗2h NF-κB、MCP-1和VEGF的表达无明显差异,但是作用6h能显著降低NF-κB、MCP-1和VEGF的表达（均P<0.05）,治疗12h后进一步降低,这些结果提示4-PBA能有效地减轻尿毒症血清引起的炎症信号的激活和炎症因子的表达。6.分子伴侣抑制尿毒症血清刺激的细胞增殖（1）尿毒症血清组:与正常血清组相比较,尿毒症血清刺激2h、6h、12h后细胞吸光度和S期细胞的比例显著增加（均P<0.05）,且随着时间的进展进一步升高;而细胞P21 mRNA表达却显著降低（P<0.05）。（2）4-PBA干预组:与尿毒症血清组相比较,4-PBA治疗6h和12h,吸光度和S期细胞的比例升高幅度有了明显的减弱,而P21 mRNA的表达下降的幅度也受到了显著抑制（P<0.05）,表明4-PBA能有效地减轻尿毒症血清引起的细胞异常增殖,恢复细胞活性的作用。结论:1.ERS是介导尿毒症血清损伤内皮细胞功能的重要分子机制。2.分子伴侣4-PBA可通过调控ERS抑制尿毒症血清诱导的内皮细胞功能损伤。