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猪呼吸道疾病综合症(porcine respiratory disease complex,PRDC)是一种常见的多因素呼吸道疾病,主要表现为呼吸困难、消瘦、嗜睡等症状,患病率和死亡率的不断攀升对养猪业造成了巨大的经济损失。病毒、细菌和支原体等等多种病原体相互在机体内作用引起的呼吸道疾病的总称,其中病毒作为主要病原体在PRDC起着至关重要的作用。本实验利用病毒宏基因组学鉴定患PRDC仔猪的血清和鼻拭子中的病毒种类,对PRDC相关的新发病毒的分子特征进行分析,取得的结果如下:1.病毒宏基因组学鉴定患PRDC仔猪中病毒种类为了鉴定患PRDC仔猪血清、鼻拭子和肺组织中的病毒种类,于2016年从四川省11个猪场中分别采集了26份具有PRDC明显症状仔猪的血清、鼻拭子和肺脏组织。样本分别处理后,得到的血清和鼻拭子样本两个pool样提取总核酸反转录成双链cDNA,建库后利用TruSeq Illumina测序,对数据库中的病毒核苷酸进行整理分析,结果显示在血清pool样中鉴定出16种病毒:猪细小病毒(PPV)6、PPV-3、PPV-5、PPV-4、PPV-2、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细环病毒1b(TTSuV-1b)、TTSuV-1a、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2(PCV-2)、猪博卡病毒5(PBoV-5)、PBoV-1、PBoV-3、猪粪便相关的环状ssDNA病毒(PigSCV)和猪巨细胞病毒(PCMV)。在鼻拭子pool样中鉴定出9种病毒:PRV、PPV-6、PPV-3、PBoV-3、TTSuV-1b、猪星状形病毒(PAstV)、PCV2、PBoV-1和PPV-2。在仔猪血清和鼻拭子中一共鉴定了17种与PRDC相关的病毒。利用SOAP软件对测序得到的序列进行组装,结果获得6种病毒完整或近似全基因组序列包括:PPV-2、PPV-3、PPV-4、PPV-5、PPV-6和PCV-2。组装的PPV-2、PPV-3、PPV-4、PPV-5、PPV-6和PCV-2与参考毒株之间核苷酸同源性分别为94.8~97.3%、96.8~99.1%、98.1~99.6%、97.0~99.5%、97.0~99.5%和95.9~99.4%。6种病毒的系统发育分析结果显示组装的PPV-3、PPV-5、PPV4和PPV-6与参考毒株之间有较近遗传距离,但组装的PPV-2和PCV-2具有独特的进化关系,表明组装的PPV-2为新的基因型,组装的PCV-2是一种新型的PCV-2e。为验证患PRDC仔猪中鉴定的17种病毒的存在和分布情况,利用RT-PCR和PCR方法对26份肺组织样本进行检测。结果显示17种病毒的检出率如下:PCV-2(96.2%)、PRRSV(84.6%)、PAstV(84.6%)、PPV-2(73.1%)、PKV(69.2%)、PCMV(57.7%)、PPV-3(53.8%)、PBoV-1(46.2%)、TTSuV-1b(42.3%)、PPV-5(34.6%)、PPV-6(34.6%)、TTSuV-1a(19.2%)、PBoV-3(15.4%)、PRV(7.69%)、PBoV-5(7.69%)、PigSCV(7.69%)和PPV-4(3.85%)。结果显示在单个肺组织样本中均至少存在7种不同的病毒,且最多可以检测到11种不同的病毒,其中PCV-2和PRRSV共感染的情况最为常见。以上结果表明四川地区患PRDC仔猪中的病毒种类复杂多样,感染情况严重复杂,混合感染普遍存在。为进一步研究26只患病仔猪中鉴定的病毒与PRDC之间的关系。我们于2016~2017年从四川省5个猪场采集了74份1~2月龄仔猪血清样本,其中36份来自患PRDC仔猪,38份来自临床健康对照仔猪。利用RT-PCR和PCR方法调查74份血清中病毒的分布情况,并使用卡方检验来调查17种病毒与PRDC之间的联系。结果显示患PRDC仔猪的单个血清样本中平均含有6.81种不同的病毒,而38份健康对照血清样本中平均含有4.09种不同的病毒。PCV-2(OR=3.22,OR 95%CI=1.22-8.47,P=0.01)或PRRSV(OR=6.5,OR 95%CI=2.34-18.0,P<0.001)的单一或共感染有较高的检出率,表明这两种病毒是与PRDC相关的重要病毒。此外,根据统计学分析发现PPV-2(OR=4.5,OR 95%CI=1.52-13.3,P=0.005),PPV-3(OR=7.38,OR 95%CI=2.35-23.2,P<0.001),PPV-6(OR=8.57,或95%CI=2.86-25.67,P<0.001)和TTSuV-1a(OR=3.96,OR 95%CI=1.39-11.31,P=0.008),以上结果表明PPV-2,PPV-3,PPV-6和TTSuV-1a与PRDC之间有潜在的联系。2.PPV-2、PPV-3、PPV-6和PCV-2的分子特征研究为了进一步了解患PRDC仔猪中主要病毒和新发病毒的分子特征,我们对26份相应的肺组织中的PPV-2和PCV-2的全基因组序列、PPV-3和PPV-6的VP1基因序列进行分析。结果从19个PPV-2阳性样本中获得了6株来自不同猪场的PPV-2全基因组序列,长度为5361~5432 bp,本研究毒株之间与参考毒株之间的核苷酸序列分别为96.3%~99.0%和94.0%~98.4%,PPV-2的系统发育分析中S1、S16、S23表现出独特的遗传进化,并且来自不同猪场的S1和S23毒株聚为一支,表明四川地区患PRDC的猪场中已经出现新型的PPV-2,且不同猪场中流通同一种新型的PPV-2。从14个PPV-3阳性样本中获得6个完整的VP1基因序列,长度为2518 bp,6个毒株之间与参考毒株之间的核苷酸同源性分别为99.5%~100%和97.3%~99.5%,系统发育分析显示本研究的6株完整PPV-3单独聚为一大支,这种遗传进化关系表明了四川地区PPV-3的进化趋势具有一致性。从9个PPV-6的阳性样本中获得来自3个部分VP1基因序列,长度为1129 bp,3个毒株之间与参考毒株之间的核苷酸同源性分别为99.6%~100%和95.5%~99.8%,系统发育分析表明本研究的PPV-6与美国毒株KSU1-AZ-2014、KSU3-KS-2014聚为一支,说明本研究毒株与美国患呼吸道疾病母猪中鉴定到的PPV-6有一定联系。从25个PCV-2阳性样本中获得来9个全基因组,长度为1767 bp~1768 bp,9个毒株之间与参考毒株之间的核苷酸同源性分别为96.3%~99.0%和94.0%~98.4%,系统发育分析显示9株PCV-2中5个毒株为PCV-2b,另外4个毒株为PCV-2d,此外,遗传进化表明S21是一种新型的PCV-2b毒株。上述结果表明了PRDC中3种新发病毒的遗传进化多样性,但其致病性有待进一步研究。此外,四川地区PCV-2的流行情况与国内的PCV-2流行情况基本一致。