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上皮间充质转化EMT(Epithelial-Mesenchymal transition,EMT)是指在相应的生理及病理环境背景下,上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,该过程中主要涉及具有极性的上皮样细胞逐渐转化为具有侵袭或者迁移能力的间充质样细胞。上皮间充质转换会导致上皮样表面分子markers蛋白表达下降,上皮细胞失去与基底膜的连接等上皮表型及细胞极性,细胞内蛋白骨架及形态发生改变重组;发生上皮间充质转换的细胞获得较高迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型,上皮标志物的丢失如E-钙黏着蛋白(E-cadherin,E-cad),同时伴有间质样分子markers表达增多和抗凋亡能力增强。涎腺腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)为一种常见头颈部恶性肿瘤,其来源于润管储备细胞的上皮来源的高度恶性唾液腺肿瘤。典型的临床及生物学特征为生长缓慢,但局部侵润性强,高度嗜神经性及肺转移性,尽管根治性手术切除以及辅助放疗已被证实可以提高患者的远期生存率,但预后仍然不尽理想。近年来,随着国内外学者对头颈部肿瘤上皮间充质转换(EMT)深入研究以及随着基因组学,表观遗传学,分子生物学等生物科学的发展及高通量测序的应用,多种非编码RNA、生长和转录因子、信号通路和表观修饰酶在SACC中逐渐揭开神秘的面纱。其中EZH2是一种在多种癌症中均表达量增多的重要蛋白,其高表达量与癌症的发展转移以及不良预后呈正相关,而在正常细胞中过表达EZH2能够增加细胞的癌变和增殖能力。在癌症中EZH2能够在多个层面对癌症的发生发展及转移进行调控。作为重要的组蛋白甲基转移酶,EZH2通过抑制基因转录在表观遗传修饰层面对靶基因进行调控,EZH2被相关转录因子招募到表皮蛋白marker的启动子区域,对其进行甲基化修饰抑制其转录表达。而EZH2也是一个诱发和促进EMT重要的关键表观修饰因子,在转录过程中其许多靶基因都是抑癌基因,对于抑制癌症转移的调控起到关键作用,说明EZH2能够促进肿瘤细胞EMT的发生。同时EZH2能够对多种抑癌基因进行转录抑制(组蛋白甲基化修饰)最终导致癌症的发展和转移。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)与头颈部恶性肿瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、和卵巢癌等多种癌症密切相关。多种相同1ncRNA在不同恶性肿瘤中起到相似的重要功能,包括无限增殖、抵抗细胞凋亡、诱发原发肿瘤灶血管生成、细胞永生化、增强侵袭转移能力和逃逸生长抑制。ANCR作为一种LncRNA最初发现能够抑制表皮祖细胞的分化,相关研究发现在祖皮细胞分化过程中,ANCR的表达量呈明显下调趋势,敲低ANCR后,能够明显促进分化的发生,并且其可以间接上调大量与分化有关基因。在乳腺癌中发现ANCR通过与EZH2结合,促进EZH2降解,抑制乳腺癌细胞侵袭迁移,并且抑制乳腺癌细胞成瘤能力和乳腺癌远端转移。但是在涎腺腺样囊性癌中是否起到相同调控作用有待进一步研究。本实验通过转化、单克隆复制以及小提验证,成功提取pWPXLd-ANCR表达质粒、pWPXLd-EZH2质粒、shANCR#1、shANCR#2干涉质粒,shEZH2#1、shEZH2#2干涉质粒、pLKO.1/pWPXLd质粒及二代包装质粒(PAX、PMD2G)。利用慢病毒包装和细胞侵染等细胞生物学实验技术使293T细胞产生ANCR及EZH2基因过表达(pWPXLd-ANCR表达质粒、pWPXLd-EZH2 质粒)及干涉(shANCR#1、shANCR#2 干涉质粒,shEZH2#1、shEZH2#2干涉质粒)的病毒液,利用PEI转染法将回收病毒液侵染sacc-lm(涎腺腺样囊性癌高肺转移细胞系)及sacc-83(涎腺腺样囊性癌低肺转移细胞系)。利用western-blot蛋白水平、real-time转录水平和流式凋亡分析分子水平检测病毒侵染后效果。本实验成功构建SACC-LM-ANCR、SACC-83-ANCR、SACC-83-EZH2、SACC-lm-EZH2,SACC-LM-shEZH2#1、SACC-LM-shEZH2#2,SACC-83-shANCR#1以及SACC-83-shANCR#2稳转细胞系。为后续功能性试验、体内实验等进一步深入性机制实验奠定基础。