一、研究背景哺乳动物成年神经再生是迄今为止最为重要的科学发现之一,成年神经再生的过程包括几个连续的步骤,其中包括成年神经干细胞的增殖。越来越多的研究表明,成年神经再生与多种生理功能有关,包括学习和记忆,而异丙酚则与学习和记忆能力密切相关。因此,我们认为异丙酚可能是一种能够调节成年神经再生的药物。目前已有学者对异丙酚在体内对成年神经再生的作用进行了研究,其结果表明经异丙酚处理后,Fisher雄性大鼠的BrdU阳性细胞数明显减少。然而,Tung等却认为应用异丙酚麻醉成年雄性SD大鼠对其神经细胞增殖并无影响。Engelhard等在比较了成年雄性SD大鼠脑缺血模型和正常对照组分别应用较低剂量异丙酚(36mg/Kg/h)3小时后,发现脑缺血组的成年神经再生现象明显增多。令人遗憾的是,另一相同的研究却发现脑缺血组与正常组并不存在差异。与异丙酚在不同研究中所出现的观点各异的结果相比,另一常用麻醉药物——七氟烷在成年神经再生中的作用却基本一致。导致上述研究结论出现争论可能与选用的实验动物的不同以及体内研究未知因素的干扰所致,从而进一步的影响了异丙酚对于成年神经再生的作用。海马成年神经再生与学习、记忆能力密切相关。在成年神经再生过程中,神经前体细胞不断增殖,其中约半数的细胞会在增殖过程中死亡。此后,存活下来的神经前体细胞在经历一系列的形态学和生理学变化后,逐渐形成树突,并具有兴奋性,最终发育成为具备记忆能力的新生神经元。这些新生神经元主要位于海马的齿状回,约在4周后具备空间学习的能力。迄今为止,异丙酚对于学习和记忆能力的影响及其机制尚未明确。有报道指出,异丙酚可以阻断工作记忆,甚至可以导致人产生健忘症。此外,亦有一些动物模型的研究发现与之类似的不良反应。但是,也有研究发现单次注射或经静脉注射异丙酚并不会引起成年或老年大鼠的记忆障碍,然而这些结果并不具有实际意义,异丙酚通常都是反复应用的,尤其是用于ICU镇静时可长达几天。而上述研究之所以会产生相互矛盾的结果,可能与不同种系对异丙酚的敏感性以及药物剂量的差异所导致。基于上述研究的基础,本研究认为体外培养的神经干细胞可以较好的明确异丙酚促进其增殖的具体作用,并有利于进一步明确其可能的分子机制,为探讨异丙酚对成年神经再生的作用及两者之间的关系奠定基础。随后,进一步推测啮齿类动物应用异丙酚重复镇静后,可能会对其空间学习和记忆能力产生一定的影响。本研究将异丙酚重复应用于Enhanced green fluorescenceprotein (EGFP)转基因小鼠,观察小鼠的空间学习能力和海马区域的成年神经再生情况,探讨异丙酚对成年神经再生的作用及两者之间的关系。二、方法体外培养的大鼠海马成年神经干细胞经BrdU预处理后,分别用10,50和100μg/ml的异丙酚进行处理,并同时设立溶媒对照和空白对照。24小时后,采用免疫组化法标记BrdU阳性细胞,DAPI复染细胞核。采用细胞计数法和MTT法检测细胞存活率。应用色度法分别检测BrdU阳性细胞核和核浓缩细胞的Caspase活性。分别检测应用cAMP反应蛋白结合元件(cAMP-response element binding protein, CREB)磷酸化特异性阻断剂KN93前后,大鼠海马成年神经干细胞胞浆内细胞信号分子的变化。Ca2+浓度采用Fura 2-AM法,CREB和磷酸化CREB的表达水平采用免疫印迹法。数据处理采用ANOVA或Student-t-test,P值<0.05认为存在统计学差异。在体内研究中,Enhanced green fluorescence protein (EGFP)转基因雄性小鼠分别经腹腔给予异丙酚或脂肪乳,每天2次,连续7天。首先,应用Morris水迷宫实验观察和评价给药28天后其空间学习和记忆能力。其次,在给药后,经腹腔注射BrdU进行标记,分别计数给药后1天、14天和28天小鼠颗粒下区BrdU阳性细胞数。最后,应用激光共聚焦显微镜观察给药后14天EGFP转基因小鼠新生神经元树突分枝数量和长度的变化。三、结果体外研究显示,低浓度(10μg/mL)异丙酚不能促进大鼠成年神经干细胞的增殖,而中浓度(50μg/m)和高浓度异丙酚(100μg/mL)则呈剂量依赖性的促进其增殖。异丙酚干预后,BrdU阳性细胞数显著增多,细胞死亡率较低(2%)。异丙酚对于Caspase-3活性的影响较小,但是显著提高了大鼠成年神经干细胞胞浆内的游离Ca2+浓度。无论异丙酚干预与否,大鼠成年神经干细胞均能表达CREB和磷酸化CREB,但是异丙酚干预后,大鼠成年神经干细胞内磷酸化CREB表达水平显著增高。应用cAMP反应蛋白结合元件(cAMP-response element binding protein, CREB)磷酸化特异性阻断剂KN93后,大鼠成年神经干细胞胞浆内的游离Ca2+浓度和磷酸化CREB表达水平显著降低。体内研究表明,在使用异丙酚镇静28天后,小鼠发现隐藏物体的时间显著延长。颗粒下区(Subgranular zone, SGZ)区域的BrdU阳性细胞数在给药后1天无明显变化,但是在14和28天后,BrdU阳性细胞数明显减少。给药后14天,两组EGFP转基因小鼠齿状回EGFP阳性细胞数占DCX阳性细胞数的比例基本一致,异丙酚镇静组新生神经元树突的长度和分枝数明显低于对照组。四、讨论在体外研究中,我们发现50μg/mL和100μg/mL异丙酚可以促进ANSCs的增殖,其效应呈剂量依赖型,而相应的溶媒和10μg/mL异丙酚则无明显促进ANSCs增殖的作用。细胞计数和MTT的结果进一步验证了此观点,但是细胞活性的增加水平,在重复的实验中并不完全一致,这可能是由于人为的细胞计数差异和细胞数及其代谢水平并不完全一致造成的。但是,我们认为通过上述可靠快速的方法足以验证异丙酚对于ANSCs增殖作用。此外,在异丙酚处理后,nestin阳性细胞仍然占据绝对多数也表明了其对ANSCs是增殖作用而非分化作用。接下来,我们检测了应用异丙酚后所增殖的细胞的变化。BrdU是一种类似于脱氧胸腺嘧啶核苷酸的化合物,可被处于增殖中的细胞整合入新合成的DNA链中。在经部分变性DNA双链后,BrdU可用免疫组织化学的方法检测出细胞正在进行DNA合成的细胞数。在本研究中,我们发现经50μg/mL异丙酚处理后的细胞,其BrdU阳性细胞所占比例显著增多,亦证实了细胞的增殖促进了细胞活性的增高。由于细胞的死亡能促进细胞的生长,为了明确这种促进可能产生的作用,我们检测了死亡细胞所占的比例。细胞计数和Caspase-3活性检测的结果均表明异丙酚对于细胞凋亡并无明显影响,也有助于我们排除因为细胞凋亡而引起细胞增殖的可能性。有学者指出,异丙酚可以提高神经胶质细胞和神经元内的Ca2+浓度,而Ca2+对于新皮质的发育和神经干细胞的增殖均具有重要的作用。在体外研究中,我们发现异丙酚处理后的细胞,其胞浆内的Ca2+浓度明显增高,提示异丙酚对于ANSCs的作用可能是通过胞浆内Ca2+浓度提高实现的。胞内磷酸化CREB蛋白表达水平的增高也进一步增加了异丙酚可能是通过Ca2+信号通路产生作用,近年的研究也发现成年啮齿类动物的神经再生过程中,CREB的磷酸化水平有着重要的作用。在进化过程中,CREB的磷酸化与ANSCs的增殖确实存在一定的关系,因此,我们认为异丙酚可能是通过激活胞浆内的感受器,如ca2+,从而改善CREB的活性,并进一步促进神经干细胞的增殖。在体外研究中,我们选择了具有较高同质性的Fisher344大鼠成年海马神经干细胞细胞系(SCR022)作为研究对象,采用了营养充分的商业化细胞培养基以及相对简单的微环境都保证了培养细胞的生长稳定性。就另一角度而言,低浓度异丙酚组的凋亡指数也较低,但是其对于细胞的增殖作用却可能为这种相对优越的生长环境所掩盖。由于中枢神经系统微环境的复杂性,如和成年神经再生密切相关的微循环,目前尚难以根据异丙酚在体外作用的推断其在体内的效应。异丙酚具有调节大脑内血流动力学的作用,并且对于内皮细胞功能状态也具有一定的调节作用,这些都可能会对异丙酚在体内的成年神经再生作用产生影响。体内研究发现,水迷宫实验观察的结果发现异丙酚重复镇静对于小鼠空间学习能力具有一定的损害作用。需要注意的出现行为学损害的时间是给药后4周,这也恰好是新生颗粒细胞具备参与到现有神经环路中的能力的时候。为了快速明确成年神经再生在这种损害中的角色和作用,我们在给药后分别计数了2组小鼠颗粒下区的BrdU阳性细胞数。在给药后1天,两组BrdU阳性细胞数的差异无统计学意义,说明异丙酚对于海马成年神经干细胞的增殖并无影响。但是,在给药后14和28天,异丙酚重复镇静组的小鼠颗粒下区BrdU阳性细胞数则显著低于溶媒对照组,提示异丙酚可能损伤的是增殖中的细胞。这些结果表明异丙酚重复镇静可损害成年神经再生,尤其是与学习能力密切相关的神经前体细胞的存活。存活下来的神经前体细胞可发育分化成不同的神经细胞,包括对于认知功能非常重要的神经元。为了进一步阐明异丙酚重复镇静对于新生神经元的影响,我们采用EGFP转基因小鼠来观察给药后2周新生神经元的发育状态。为了进一步明确EGFP阳性细胞的性质,我们选择了DCX,一种成年海马齿状回新生神经元可靠的标志物,对其进行免疫染色。在本研究中,几乎所有的DCX阳性细胞同时也是EGFP阳性细胞,说明这两种标记方法的一致性,也为后续对新生神经元的研究奠定了基础。异丙酚镇静组的EGFP阳性细胞数在给药后14天显著减少,与BrdU阳性细胞计数的结果一致,表明该组神经前体细胞存活较少。同时,该组的新生神经元在形态学上的成熟度显著延迟。我们的结果表明异丙酚镇静组新生神经元的树突结构的复杂度,无论是在长度、分枝数目上均显著减少。研究表明,树突结构的微小变化即可明显影响神经元生物物理学特性,并显著改变其传递信息的方式。在既往的几个动物模型中均已证实树突结构的复杂度与依赖海马的学习能力如丰富环境、主动练习和短光照时间等密切相关。在神经元的发育过程中,树突结构的复杂度是其成熟度的一个重要标志,同时也能够说明其未来的学习能力。因此,由异丙酚镇静所造成的成年神经再生能力的下降,不仅表现在新生神经元的数量上,而且也引起新生神经元形态学的改变,由此亦不难推断出其后发生的行为学损害。体内研究的结果表明,异丙酚对于成年神经再生和学习能力均有一定的毒性作用,提示麻醉医生和临床医生在使用异丙酚进行重复镇静的时候,需要注意其损害作用。此外,本研究成功构建了一个由麻醉药物毒性引起小鼠海马成年神经再生受损而造成的空间学习能力下降的动物模型。五、结论异丙酚在体外可能是通过激活胞浆内的感受器,如Ca2+,从而改善CREB的活性,并进一步促进神经干细胞的增殖。而在体外,异丙酚在重复镇静EGFP转基因小鼠后,对其空间学习能力有一定损害作用,此外尚能造成小鼠海马齿状回颗粒下层的新生神经元数量的下降和树突形态发育的不成熟。