温阳散瘀平喘方治疗儿童哮喘临床试验及调控miR19a介导的JAK/STAT-NF-κB通路机制研究

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目的:观察温阳散瘀平喘方与布地奈德联合特布他林对寒性哮喘急性期患儿的临床疗效;建立哮喘小鼠模型,探讨温阳散瘀平喘方对于气道炎症的干预机制,找出最佳干预时机;分析“阳虚”与“mi R19a”、“肺脾肾”与“通路负调控因子”、“痰瘀互结”与“气道炎症”、“阴阳平衡”与“Th1/Th2平衡”的潜在关系。方法:1.纳入符合标准的寒性哮喘患儿120例,采用随机对照方法进行分组,每组60例,对照组予布地奈德联合特布他林,治疗组在对照组基础上加用温阳散瘀平喘方,用药1周,收集两组患儿一般资料、治疗前后中医证候积分、肺功能(PEF、FVC、FEV1)、呼吸频率、心率、EOS、肝肾功能;治疗前后用ELISA检测血清中Ig E、IL-4、IL-13、IFN-γ;用RT-PCR检测mi R19a、STAT6、p65、SOCS1、Tnfaip3。2.选取80只BALB/c小鼠随机分为空白对照组、哮喘模型组、地塞米松组、温阳散瘀平喘方组,除空白对照组外,其余三组建立支气管哮喘小鼠模型,药物分别干预7天和28天,观察小鼠外观体征及行为;用细胞计数法观察BALF中炎性细胞;用HE染色观察肺组织病理改变;用ELISA检测BALF中IL-4、IL-13、IFN-γ水平;PCR检测肺组织中mi R19a、IL-13、IL-4、IFN-γm RNA含量;western blot检测肺组织中STAT6、p-STAT6、p65、p-p65、SOCS1、Tnfaip3蛋白含量;免疫组化法检测肺组织中STAT6、p65、SOCS1、Tnfaip3阳性表达。结果:1.与治疗前比较,治疗后两组患儿哮喘控制水平提高;中医证候疗效升高,总积分降低(P<0.01);肺功能PEF、FVC、FEV1水平升高(P<0.01);EOS,Ig E水平降低(P<0.01);IL-4、IL-13水平降低(P<0.01),IFN-γ水平升高(P<0.01);mi R19a、STAT6、p65 m RNA含量降低(P<0.01),SOCS1、Tnfaip3m RNA含量升高(P<0.01);呼吸频率、心率减缓(P<0.01)。治疗后,两组组间比较,治疗组哮喘控制水平优于对照组(P<0.05);治疗组中医证候疗效、积分改善优于对照组(P<0.01),且治疗组在喘息,胸闷主症以及形寒怕冷,小便清长兼症优于对照组(P<0.05);治疗组肺功能PEF、FVC、FEV1水平较对照组升高(P<0.01);治疗组EOS,Ig E水平较对照组降低(P<0.01);治疗组IL-4、IL-13水平较对照组降低(P<0.01),IFN-γ水平较对照组升高(P<0.01);治疗组mi R19a、STAT6、p65 m RNA含量较对照组降低(P<0.01),SOCS1、Tnfaip3 m RNA含量较对照组升高(P<0.01);治疗组呼吸频率、心率较对照组减缓(P<0.05)。两组患儿均未出现明显不良反应。2.哮喘模型组符合哮喘典型症状体征及病理表现,造模成功;哮喘模型组EOS、NEU计数与Ig E水平升高,两给药组EOS、NEU计数与Ig E水平降低(P<0.01);哮喘模型组IL-4,IL-13水平及m RNA含量升高,IFN-γ水平及m RNA含量降低,两给药组IL-4,IL-13水平及m RNA含量降低(P<0.01),IFN-γ水平及m RNA含量升高(P<0.01);哮喘模型组mi R19a m RNA含量升高,STAT6、p-STAT6、p65、p-p65蛋白含量升高,STAT6、p65阳性表达升高,SOCS1和Tnfaip3蛋白含量与阳性表达降低,两给药组mi R19a m RNA含量降低(P<0.001),STAT6、p-STAT6、p65、p-p65蛋白含量降低(P<0.05),STAT6、p65阳性表达降低(P<0.05),SOCS1和Tnfaip3蛋白含量与阳性表达升高(P<0.01);干预28天,温阳散瘀平喘方降低EOS、Ig E、IL-4、IL-13、STAT6、p65、p-p65,升高SOCS1、Tnfaip3作用与地塞米松相当(P>0.05);干预28天两给药组降低EOS、Ig E、IL-4、IL-13、mi R19a的作用优于干预7天(P<0.05);干预7天,两给药组小鼠体重增加(P<0.01),干预28天,地塞米松组小鼠体重减轻(P<0.05),温阳散瘀平喘方组小鼠体重增加(P<0.05),两给药组肺组织病理切片较干预7天改善。结论:1.温阳散瘀平喘方合布地奈德联合特布他林可改善急性期寒性哮喘患儿病情、中医证候、肺功能、血清学指标、呼吸频率、心率,其疗效优于西药单独使用方案,且治疗过程中,未见明显不良反应。2.哮喘模型小鼠存在Th1/Th2免疫失衡以及mi R19a介导的气道炎症改变。两给药组对上述病理环节均有干预作用,温阳散瘀平喘方作用与地塞米松相似,最佳干预时机是28天,且干预28天,温阳散瘀平喘方的作用与地塞米松相当。干预28天地塞米松组小鼠体重减轻。3.温阳散瘀平喘方可能是通过调控mi R19a/JAK/STAT-NF-κB信号通路活性缓解哮喘气道炎症。4.“阳虚”与“mi R19a”、“肺脾肾”与“通路负调控因子”、“痰瘀互结”与“气道炎症”、“阴阳平衡”与“Th1/Th2平衡”之间密切相关。
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