论文部分内容阅读
目的:1.观察缺血再灌注损伤对大鼠肾脏组织形态、超微结构、中性粒细胞浸润程度和肾功能的影响2.检测肾组织中MMP-2,MMP-9蛋白的表达变化,探讨它们在肾缺血再灌注损伤中的作用及作用机制。3.检测肾组织中p38MAPK蛋白的表达变化,以探讨MMP-2,MMP-9蛋白表达变化的机制。4.探讨米诺环素预处理对缺血再灌注后肾组织和肾功能损伤的保护作用及其对肾组织中p38MAPK、MMP-2,MMP-9蛋白表达的影响,揭示其对肾缺血再灌注损伤的保护作用机制。方法:选择72只健康雄性SD大鼠,随机分为3组:对照组(Con)组,缺血再灌注(IR)组,米诺环素预处理(M)组,每组24只,每组按取肾时间不同分为4个时相(6 h,12 h,24 h ,72 h),每个时相6只大鼠。手术方法:Con组:实验大鼠仅切除右肾但不夹闭左肾动脉;IR组采用切除右肾,夹闭左肾动脉45分钟后恢复灌流建立缺血再灌注损伤模型;M组:大鼠手术前36h经鼻胃管给药(45mg/Kg),以后每隔12h给药1次(22.5mg/Kg),共4次,手术方式同IR组。光学显微镜观察肾组织学变化。用透射电镜观察肾组织超微结构的变化。检测肾组织中MPO活性以提示中性粒细胞在组织中的浸润情况。测定血清肌酐(Scr)水平,以反映肾功能损害的程度。免疫组化二步法检测肾组织中p38MAPK, MMP-2, MMP-9蛋白表达水平。对结果进行方差分析及Pearson相关性分析。结果:1. Con组肾组织形态学和超微结构未见明显异常。IR组肾组织出现明显的组织学及超微结构损伤,主要表现为:光镜下,肾小管上皮细胞坏死、脱落,管壁完整性破坏;电镜下,肾小管上皮细胞线粒体肿胀,部分粗面内质网扩张,核肿胀或固缩、碎裂,染色质边集。M组上述损伤明显减轻,肾小管形态正常,管壁完整;上皮细胞胞质轻度空泡变性,部分线粒体轻度肿胀,部分内质网轻度扩张。2. Con组肾组织MPO活性维持在较低水平,各时相之间无明显差异(P>0.05);IR组肾组织中MPO活性于再灌注后6h开始升高(0.539±0.081),且随再灌注时间延长,肾组织MPO活性逐渐增强,24h达高峰(0.767±0.102),72h后开始下降(0.528±0.072),各时间点与Con组比较差异均有显著性(P<0.01)。M组再灌注后6h、12h、24h、72hMPO活性分别为0.431±0.075、0.507±0.076、0.612±0.081、0.415±0.093,与IR组比较差异具有显著性(P <0.05)。3. Con组各时相Scr水平较低,约40.58μmol/L左右; IR组Scr水平于再灌注后6h开始升高(106.33±12.74μmol/L),12h为165.31±19.19μmol/L ,24h达到峰值(201.33±21.52μmol/L),72h后已下降(90.17±15.87μmol/L),各时相与Con组相比差异均有显著性(P<0.01),M组Scr水平显著低于IR组(P<0.01),各时相分别为61.50±11.50μmol/L、87.50±14.18μmol/L、113.83±17.21μmol/L、56.00±13.76μmol/L。4. MMP-2蛋白在Con组肾组织微量表达,阳性面积百分比在1.71%左右;IR组再灌注6h MMP-2蛋白开始表达(19.42±2.50%),12h表达继续增强(29.26±3.74%),24h达高峰(34.61±6.08%),72h表达开始减弱(18.78±1.86%),各时相与Con组相比差异有显著性(P<0.05);M组肾组织MMP-2蛋白表达明显减弱,6h(12.46±2.51%)、12h(15.08±3.27%)、24h(19.28±1.96%)与IR组比较有统计学意义(P<0.05)。5. MMP-9蛋白在Con组肾组织微量表达,阳性面积百分比在1.63%左右;IR组再灌注6h MMP-9蛋白表达开始增强(21.59±1.98%),12h表达继续增强(30.18±3.45%),24h达高峰(36.05±4.75%),72h表达开始减弱(19.51±2.31%),各时相与Con组相比差异有显著性(P<0.05);M组6h、12h、24h MMP-9蛋白表达明显减弱(14.57±2.21%,20.69±3.39%,24.86±3.70%),与IR组比较有统计学意义(P<0.05)。6. p38MAPK蛋白在Con组肾组织微量表达,阳性面积百分比在1.67%左右;IR组p38MAPK蛋白表达显著高于Con组(P<0.05),6h、12h、24h、72h阳性面积百分比为25.60±3.39%、39.83±5.23%、28.84±4.06%、17.95±1.74%;M组在6h、12h p38MAPK蛋白表达明显减弱(21.56±3.11%,27.61±3.41%),与IR组比较差异有显著性(P<0.05)。7.在IR组中,MMP-2蛋白表达水平与Scr水平和MPO活性呈显著性正相关关系(r=0.763,P <0.01;r=0.752,P <0.01)。MMP-9蛋白表达水平与Scr水平和MPO活性呈显著性正相关关系(r=0.874, P <0.01;r=0.693,P <0.01)。p38MAPK蛋白表达与MMP-2,MMP-9蛋白表达呈显著正相关关系(r=0.585,P<0.01;r=0.598,P<0.05)。结论:1.缺血45分钟后恢复灌注,可导致实验大鼠肾组织学和超微结构损伤,促进中性粒细胞向组织中浸润,最终引起肾功能减退。2.缺血再灌注后MMP-2, MMP-9蛋白在肾组织中表达增加,二者在表达时间上相平行,表达增加的趋势一致,且均为明胶酶,有共同的作用底物,我们认为它们能协同降解ECM加重肾组织的损伤,最终导致肾功能下降。3.缺血再灌注后肾组织中p38MAPK表达增加,且p38MAPK表达与MMP-2, MMP-9的表达成显著正相关关系,因p38MAPK可以在转录水平调节基因表达,我们认为肾缺血再灌注后p38MAPK可诱导MMP-2, MMP-9的表达。4.米诺环素能够减轻缺血再灌注后肾组织结构的损伤,抑制中性粒细胞向组织中的浸润,改善肾功能,对肾缺血再灌注损伤具有明显的保护作用;米诺环素可以抑制缺血再灌注后p38MAPK的激活,降低MMP-2, MMP-9蛋白的表达;我们认为米诺环素抑制p38MAPK,降低MMP-2, MMP-9蛋白表达是其对肾缺血再灌注损伤的保护作用机制之一。