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莨菪（Hyoscyamus niger）属于茄科的药用植物,其整个植株含有托品烷生物碱（Tropane alkaloids,TAs）,主要包括莨菪碱和东莨菪碱,可用来作为抗胆碱药物。由于TAs化学合成成本过高没有商业化前景,因此仍然是从药源植物中进行提取。莨菪碱和东莨菪碱皆可作为抗胆碱药物,但东莨菪碱比莨菪碱的药效更优且副作用小,因此东莨菪碱的经济价值更高。托品烷生物碱在植物中含量很低,代谢工程是培育该类生物碱高产药源植物的重要手段之一,而对TAs生物合成途径的分子生物学和生物化学的研究是开展代谢工程的前题。腐胺N-甲基转移酶（Putrescine N-methyltransferase,PMT）催化腐胺的N-甲基化形成N-甲基腐胺,是尼古丁和TAs等生物碱的重要前体。大量研究表明,PMT是尼古丁生物合成中的第一个限速酶。但是,PMT在TAs生物合成和调节多胺代谢中的研究还有待深入。本研究基于我们实验室自己测定的莨菪转录组数据库（未公布）,筛选到一条编码腐胺N-甲基转移酶的基因,命名为HnPMT。对HnPMT进行生物信息学和表达模式分析;在大肠杆菌中重组并纯化该蛋白,对重组HnPMT采用前体饲喂进行酶活性分析,并对其酶动力学进行了研究;最后在莨菪植株中采用VIGS抑制HnPMT表达,考察其对TAs生物合成和多胺代谢的影响。HnPMT基因克隆和生物信息学分析。基于莨菪转录组数据库,克隆得到HnPMT基因,将其连接T载体并进行测序。结果表明,HnPMT的cDNA全长为1534 bp,包含一段1014 bp的编码区,编码1个338个氨基酸残基的多肽,其分子量为37 kDa,等电点为5.78。通过HnPMT氨基酸序列多重比对显示,HnPMT与茄科其他物种的PMT相似度较高;系统进化树分析表明,PMT家族形成一支,而SPDS家族形成另一支,其中HnPMT位于PMT家族而不是SPDS家族。根据生物信息学分析,该HnPMT可能具有腐胺N-甲基转移酶的功能并参与TAs的合成。HnPMT表达分析。通过对莨菪根和叶片组织进行HnPMT的表达分析,结果表明,HnPMT在根中特异性表达。将莨菪毛状根在含有MeJA的WPM液体培养基中进行时间梯度处理后,随着MeJA处理时间的增加,HnPMT的表达量也在显著地升高,在12 h时HnPMT表达量达到了最大值。HnPMT表达模式分析表明,HnPMT具有根特异性表达和受MeJA诱导表达的特征。重组HnPMT蛋白质的纯化与活性鉴定。将HnPMT连在原核表达载体pET28a（+）,带有His标签的重组蛋白在大肠杆菌Rosetta中进行原核表达,经过优化诱导以及纯化条件,获得HnPMT重组蛋白质。经过SDS-PAGE凝胶电泳并与蛋白Marker进行比对,HnPMT重组蛋白质的大小约为40 kDa。采用镍柱纯化HnPMT重组蛋白质进行前体饲喂实验,利用LC-MS测定苯甲酰化的HnPMT反应样品、对照样品以及标品。LC-MS分析结果表明,苯甲酰化的N-甲基腐胺标准品保留时间为11.85 min,在同样的保留时间下,检测到HnPMT反应样品中存在苯甲酰化N-甲基腐胺,但在对照反应中未检测到;随后将HnPMT催化产生的产物峰进行质谱鉴定,其质荷比（m/z）与苯甲酰化的N-甲基腐胺标准品一致。酶活分析结果表明HnPMT具有催化腐胺形成N-甲基腐胺的功能。HnPMT的酶动力学研究。将HnPMT在不同pH（7.5-9.5）和温度（22℃-46℃）下进行酶活性的分析,结果表明,HnPMT在pH 9.0,温度40℃时活性最高。在最适反应条件下进行酶动力学的分析,设定底物腐胺浓度范围为0.05 mM-5 mM,根据米曼氏动力学曲线,获得酶动力学参数。HnPMT的Km为74μM、Vmax为0.416 nkat·mg-1、Kcat为0.0173 s-1。与已经报道的PMT酶的酶动力学参数比较,HnPMT的Km较低,表明其与腐胺的亲和力较高;HnPMT的Kcat较小,表明其对底物腐胺的催化效率较低。酶动力学研究结果表明,HnPMT对腐胺具有较高亲和力但催化效率非常低,极有可能是在莨菪TAs生物合成途径中的一个限速酶。沉默HnPMT对TAs生物合成和多胺代谢的影响。在莨菪植株中,利用病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）方法将HnPMT基因沉默。通过qPCR检测转基因莨菪中HnPMT的表达水平,结果表明VIGS组相较于对照组,HnPMT表达量下降了8倍。通过测定HnPMT的直接产物N-甲基腐胺和下游的目标产物莨菪碱的含量,在HnPMT沉默后,两种物质的含量皆极显著下降,对照组的N-甲基腐胺含量为0.21μg/g（FW）,而VIGS组的N-甲基腐胺含量为0.092μg/g（FW）;对照组中莨菪碱含量为1.30μg/g（DW）,而HnPMT沉默后,VIGS组的莨菪碱含量仅为0.842μg/g（DW）表明在HnPMT被沉默后,导致N-甲基腐胺合成大幅度减少,从而限制了下游产物莨菪碱的合成。同时测定了莨菪中多胺的含量,结果表明HnPMT被沉默后,腐胺、亚精胺和精胺的含量均提高。代谢产物分析表明HnPMT沉默不仅降低了直接产物N-甲基腐胺的生物合成,而且导致了下游产物莨菪碱积累减少,但同时促进了多胺在莨菪中的积累。综上所述,HnPMT在莨菪根中特异表达,能够催化腐胺生成N-甲基腐胺,对腐胺亲和性较高但催化活性较低;沉默HnPMT减少了N-甲基腐胺和莨菪碱的生物合成,同时增加了多胺的积累。HnPMT的克隆及活性鉴定有助于进一步认识该酶在TAs生物合成和多胺代谢调控中的作用。