LonP1与精子活力和精子线粒体稳态的关联性研究

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:healthborn
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目的:  探究Lon蛋白酶1(LonP1)对精子活力改善和线粒体稳态的维持是否存在调节作用及其可能存在的调节机制。  方法:  从温州医科大学附属第二医院收集120名男性捐献者的精液标本,分为正常活力精子(NS)和弱精子症精子(AS)两组,采用计算机辅助精液分析系统(CASA)检测精子运动参数,免疫荧光法确定LonP1在精子中的表达和定位,蛋白印迹法(WB)和实时荧光定量核酸扩增检测系统法(qPCR)检测精子中NS组和AS组精子的LonP1的表达差异及线粒体自噬相关指标Pink1、Parkin的表达差异,WB检测NS组和AS组组间线粒体形态指标Mfn2与Drp1的表达水平,流式细胞术检测NS组和AS组组间精子线粒体膜电位强度(MMP)和线粒体活性氧(mROS)水平,ATP检测试剂分析NS组和AS组组间ATP含量差异,继而分析LonP1表达与精子活力,精子线粒体形态(Mfn2/Drp1比值),线粒体自噬水平(Pink1、Parkin)和线粒体功能相关指标(ATP,MMP,mROS)的关联性。采用密度梯度离心法处理NS组精液,选取离心沉淀的精子为研究对象,以LonP1功能抑制剂CDDO-ME 2.5μmol/L和5μmol/L为终浓度进行体外培养2小时,同时设置空白对照组,继而检测CDDO-ME处理组和空白对照组的精子运动参数,LonP1表达水平,线粒体形态指标,线粒体自噬水平及精子线粒体功能相关指标,以进一步验证LonP1与精子活力和精子线粒体稳态的关联性。  结果:  ①人类成熟精子中存在LonP1的表达,且稳定表达于精子中段的线粒体鞘部;  ② NS组和AS组精子LonP1蛋白表达水平和mRNA表达水平分别为(0.52 vs. 0.22和1.00 vs. 0.66),当LonP1表达水平高时,精子活力(67.62% vs. 22.97%)、MMP水平(绿色荧光/红色荧光强度%)(4.72% vs.12.73%)、ATP含量(711.89 vs. 545.26)、Mfn2/Drp1比值(12.48 vs. 3.29)、Pink1蛋白和mRNA表达水平(2.41 vs.0.26;1.00 vs.0.28)和Parkin蛋白和mRNA表达水平(3.02 vs.0.17;1.00 vs. 0.17)均较高,且具有统计学意义(P<0.05),而mROS含量明显较低(418.85 vs. 460.52)(P<0.05)。  ③ 经LonP1功能抑制剂CDDO-ME处理后,与空白对照组比较,CDDO-ME药物处理组的LonP1表达水平和ATP含量均随CDDO-ME作用浓度增加显著降低(P<0.05);与此同时,5μmol/L浓度组的各指标较空白对照组, MMP水平下降(78.81% vs. 7.34%)、Mfn2/Drp1比值下降(1.35 vs. 1.61)、Pink1 mRNA表达下降(0.50 vs. 1.00)、Parkin蛋白和mRNA表达均下降(2.13 vs. 2.82和0.60 vs. 1.00),而mROS水平增加(640.68 vs. 462.26),差异均有统计学意义(P<0.05)。  ④ CDDO-ME处理后,除精子的活率(PR+NP)无明显变化,精子运动参数平均路径(VAP)和曲线速率(VSL)均随CDDO-ME作用浓度增加而显著下降(P<0.05);5 μmol/L浓度组的精子运动参数相较空白对照组,精子活力(PR)( 60.37% vs. 66.17%)、曲线速率(VCL)( 65.90 μm/s vs. 79.28 μm/s)、侧摆幅度(ALH)(1.42 μm vs. 1.96 μm)、直线性(LIN)( 39.05% vs. 53.25%)和前向性(STR)( 59.03% vs. 77.42%)均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。  结论:  精子线粒体鞘部存在LonP1的稳定表达;LonP1功能抑制后,精子活力,精子线粒体形态和功能及线粒体自噬相关指标均发生下降,说明 LonP1表达与精子活力,精子线粒体稳态和线粒体自噬存在关联性,可能通过精子线粒体稳态维持来改善精子活力,LonP1可能与线粒体自噬共同维持调节线粒体稳态来改善精子活力。
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