家蚕抗菌肽CecropinB是家蚕免疫系统产生的一种具有生物活性的小分子多肽,无分子内的二硫键,分子质量约为4kDa,其N端和C端分别具有强碱性和强疏水性。抗菌肽CecropinB具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等作用,此外抗菌肽还可作为绿色健康的饲料添加剂应用在畜牧生产中,促进动物健康生长,提高动物自身免疫力,因此抗菌肽的研究已成为生命科学领域的一大热点。抗菌肽从生物组织中分离获得大量的抗菌肽难度大,成本高,以融合蛋白的形式表达,表达产物活性较低,纯化过程比较复杂,并且翻译后加工修饰不完善,而采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统所产生的重组病毒多数情况下通过皮下注射的方式接种昆虫,效率低下,因此通过构建可同时表达polh基因和外源目的基因的真核表达系统进行抗菌肽基因工程的研究已成为一个热门话题。　　本研究应用Bac-to-Bac表达系统,构建含有家蚕抗菌肽cecropinB2基因与polh基因的双启动子载体,在家蚕中表达,获得具有抑菌活性的CecropinB抗菌肽,并进行表达量分析,研究结果如下:　　1.获得重组杆状病毒BmNPV-CecB2/polh　　分别以质粒PET-32a-BmCecB2和野生型T3株基因组DNA为模板进行PCR扩增,合成BmCecB2基因和polh基因,再将两个基因克隆到pFastBacDual转移载体Pp10和Pph的MCS的下游,构建重组质粒pFastBacDual-CecB2/polh,再转化到DH10BacE.coli感受态细胞,发生转座,获得重组Bacmid-CecB2/polh,BacmidDNA通过转染BmN细胞获得重组杆状病毒BmNPV-CecB2/polh。　　2.目的基因在家蚕幼虫中表达及鉴定　　重组Bacmid-CecB2/polh通过脂质体介导转染BmN细胞,转染72h后,BmN细胞有明显的感染症状,在显微镜下可见细胞呈现圆球形,并能观察到大量的多角体。重组病毒液经口添食家蚕幼虫,144h后,添食重组病毒的家蚕有明显感染症状,蚕血呈乳白色,收集受感染家蚕的血液,超声裂解细胞,Tricine-SDS-PAGE结果表明家蚕抗菌肽cecropinB基因与polh基因在家蚕体中均得到表达,家蚕抗菌肽cecropinB基因大小约为4.9KD,polh基因大小约为29KD。抑菌试验的结果显示表达的家蚕抗菌肽CecropinB具有抑菌活性,抑菌直径为10mm。ELISA表达量检测结果得知蚕体粗提物中BmCecB2平均浓度0.115μg/mL,蚕血BmCecB2平均浓度为0.109μg/mL,为今后进一步的实验研究提供依据。　　通过以上研究结果表明,构建双启动子表达载体同时表达家蚕抗菌肽cecropinB基因及polh基因,由此获得的重组病毒既可以在家蚕培养细胞内表达,也可以利用多角体经口添食感染家蚕幼虫实现高效率表达,为大规模生产及畜牧业应用提供理论基础。