背景：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)呈世界性流行,为肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)等一系列终末期肝病发生的主要危险因素。肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤的修复反应,其本质是细胞外基质过度沉积并最终发展成为肝硬化。慢性HBV感染进展为肝硬化5年累积发生率8%-20%。而肝硬化为预测HCC发生的独立预测因素,肝硬化患者中HCC年发生率3%-6%。因此肝组织纤维化程度与慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者长期肝脏疾病进展风险存在明确关系。然而肝脏亦是人体中的一个沉默器官,当患者出现典型症状和体征时,多数则可能已进展为肝硬化甚至出现肝衰竭。肝纤维化诊断技术目前分成两大类：一为无创技术,如基于肝脏瞬时弹性成像技术(transient elastography,TE)的肝硬度测量(liver stiffness measurement,LSM)是新近用于评估肝纤维化的无创性诊断方法,其优势在于无创伤性、操作简便、可重复性,能够比较准确地识别出进展性肝纤维化及早期肝硬化,目前在国内已被批准临床使用。然而基于TE的LSM在临床检测过程中仍受到一定限制,如不能检测炎症活动度、难以区分轻中度肝纤维化改变(FO-F2)以及受到肝脏炎症和肥胖等伴发疾病因素影响。二为有创技术,如肝穿刺活组织检查,缺点为有创性而导致依从性低及难以重复检查,且因肝组织标本取样误差及标本较小而导致肝纤维化准确性不足因而受到限制,但其依然为诊断肝纤维化程度的“金标准”。对CHB患者肝病进展及时准确地进行病情诊断、评估和监测,并给予合适患者抗病毒治疗是CHB管理的关键步骤。肝组织学分析所观察的肝纤维化、炎症损伤等病理性变化对慢性肝病的重要诊治价值目前尚不能被其它临床检查替代。就CHB患者,2012年亚太肝病协会(Asian-Pacific Association for the Study of the Liver, APASL)与2009年美国肝病协会(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)指南均提出,对年龄大于40岁且伴有病毒血症,特别是血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)水平处于正常高值或轻度升高介于1-2×正常值上限(upper limit normal,ULN)的患者,建议进行肝活检。2012年欧洲肝病协会(European Association for the Study of the Liver,EASL)指南则建议,对于ALT水平升高的HBeAg阳性或阴性患者,以及处于免疫耐受期且年龄大于30岁伴或不伴有肝硬化及HCC家族史的患者,均应考虑进行肝活检甚至可给予抗病毒治疗。通过对不同指南之间进行比较,可发现它们对于哪类CHB患者,特别是伴持续ALT正常(persistent normal ALT,PNALT)患者中哪些需要接受肝活检的建议存在一定差异。因此,2012年EASL指南中最后建议将来HBV研究重点问题之一是探索处于免疫耐受期患者以及HBeAg阴性且HBV DNA低于20,000IU/ml(100,000copies/ml)CHB患者的治疗指征。血清ALT是目前临床应用最为广泛、常规反映肝脏组织损伤水平的实验室生化指标。目前ALT的传统ULN为40U/L,然而有研究认为当初制定该界值时,作为正常参照值的人群中很可能包括了一部分伴有亚临床肝病(慢性丙型肝炎以及非酒精脂肪肝等)者。同时较多临床研究发现,ALT常不能鉴别出伴有轻度至中度炎症活动的肝病患者。因此,有学者质疑ALT的传统ULN水平值设定是否适当,并认为该问题可能是导致慢性肝脏疾病发病率被低估的重要原因之一,因此提出应该对其进行修正。欧洲研究发现ALT的ULN应在男性降至30U/L、女性降至19U/L,而韩国提出修改ULN为男性33U/L、女性25U/L。修订ALT的ULN,如果对照肝组织学损伤程度进行,理论上将更具有准确性。但是,目前以CHB患者作为研究对象探讨ALT的ULN与肝组织病理变化关系的文献报道较少。终末期肝病患者病死率高,HBV感染是引起终末期肝病发生的主要原因之一,其相关发生机制仍不明确。病毒变异可能通过多种机制诱发终末期肝病。近期研究探讨较多的为HBV基因型以及前C(precore, PC)/C基因启动子区变异与HBV相关终末期肝病的关系。既往文献报道,基因型B可能为HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV related-acute-on-chronic liver failure,HB-ACLF)发生的危险因素,而基因型C则与HCC发生密切相关。本实验室前期研究发现,基因型B感染者中伴PC区中的G1896A变异和基本核心启动子(basal core promoter,BCP)区中的A1762T/G1764A变异会增加HB-ACLF风险；而对肝衰竭患者HBV全基因组序列纵向比较则发现,C53T, A1846T以及G1896A变异与HB-ACLF发生密切相关。关于HBV变异与肝硬化之间的关系,BCP区中A1762T/G1764A双变异可能导致肝细胞损伤,从而使慢性肝病由无症状HBV携带者或慢性肝炎向肝硬化发展。国内一项相关研究发现A1762T/G1764A、T1768A和A1846T变异均与肝硬化的发生独立相关。在HBV相关HCC不同研究中发现,A1762T/G1764A变异会使HCC发生风险明显增加,并且为独立预测肝癌术后生存率的重要指标之一。可是近期有文献报道T1674C/G变异对于HCC才具有高度特异性。从HBV基因型及基因变异角度寻找CHB患者疾病严重程度的生物学标记,比较CHB患者不同肝组织病理学变化程度的HBV序列也许更为合适,然而目前相关研究报道较少。目的：本研究首先通过大样本量回顾性分析我国CHB患者的肝组织病理学变化特征,然后探讨ALT的ULN、HBV基因型以及前C/C基因启动子区变异与肝组织病理学变化的关系,寻找影响CHB患者肝组织病理改变的病毒因素,为疾病进展提供初步实验依据。方法：本研究一共分为三部分,对象均为接受肝穿刺术且初治的CHB患者：第一部分共纳入675例CHB患者,探讨肝组织病理改变特征；第二部分共纳入167例伴PNALT的CHB患者,探讨ALT的ULN与肝组织病理学改变的关系；第三部分纳入冻存有相应血清标本的CHB患者219例,探讨HBV基因型及前C/C基因启动子区变异与肝组织病理学变化的关系。CHB诊断按照临床检查和肝功能检测结果确诊,血清标志物检测采用化学发光免疫分析仪进行,肝功能检测包括转氨酶等。所有患者均排除有丙、丁、戊型肝炎病毒合并感染。PNALT定义为连续至少三次ALT等于或低于ULN、每次间隔6至12个月,患者总观察时间为18至36个月,且在接受肝活检前的任何时间点均未发现ALT升高。肝脏病理学诊断炎症活动度与纤维化分期均参考Metavir评分标准,显著性肝组织学异常定义为肝脏炎症活动度≥A2和/或肝纤维化分期≥F2。抽提血清中的HBVDNA并进行PCR扩增,首先扩增HBV的S基因区进行基因型和基因亚型分析,扩增引物为BS1和Po12,如果第一轮PCR结果为阴性,则使用引物BS1和P29进行半巢式PCR扩增,扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,然后应用测序仪检测序列。前C/C基因区的扩增用引物Is2-2和P30A进行第一轮PCR扩增,用引物Is2-2和HC24R进行第二轮扩增,扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,然后通过测序仪进行检测核酸序列。测序结果使用Lasergene software suite V6.0, DNASTAR处理,然后用CLUSTALW1.8进行排列比对,和GenBank/EMBL/DDBJ数据库中A-G7种HBV基因型作为参考序列比较,进化树分析通过MEGA4.0软件。数据的统计分析应用SPSS13.0软件,各参数通过均数±标准差或患者的数量(%)表达,两组之间计量资料比较应用两独立样本非参数检验,两组之间计数资料比较采用x2检验,应用Logistic回归分析各参数与显著性肝组织学异常的关系,以a=0.05作为检验水准,P<0.05为有统计学意义。结果：1) HBeAg阳性CHB患者(n=516)中,不同ALT水平的显著性肝脏炎症发生率：PNALT组1.2%(1/85)、ALT1-2×ULN组23.8%(30/126)以及ALT>2×ULN组51.1%(156/305)。而不同ALT水平的显著性肝纤维化发生率：PNALT组49.4%(42/85)、ALT1-2×ULN组69.8%(88/126)以及ALT>2×ULN组81.6%(249/305)。ALT>2×ULN组患者显著性肝脏炎症和肝纤维化发生率均较PNALT组和ALT1-2×ULN组的显著增高(P值均<0.001)。2)伴PNALT的HBeAg阳性CHB患者(n=85)中,ALT≤0.5×ULN(n=14)与ALT0.5-1×ULN(n=71)两组比较,显著性肝脏炎症发生率无显著性差异(0.0%vs1.4%,P=1.000),显著性肝纤维化发生率亦相似(57.1%vs47.9%,P=0.527)。患者按照30岁年龄进行分组分析,年龄<30岁组(n=77)与>30岁组(n=8)患者之间显著性肝脏炎症发生率无显著性差异(1.3%vs0.0%,P=1.000),可是年龄>30岁组患者显著性肝纤维化发生率较年龄≤30岁组患者的明显升高(87.5%vs45.5%,P=0.058)。3) HBeAg阴性CHB患者(n=159)中,不同ALT水平的显著性肝脏炎症发生率：PNALT组9.1%(5/55)、ALT1-2×ULN组17.8%(8/45)与ALT>2×ULN组57.6%(34/59)。而不同ALT水平的显著性肝纤维化发生率：PNALT组30.9%(17/55)、ALT1-2×ULN组73.3%(33/45)与ALT>2×ULN组94.9%(56/59)。ALT>2×ULN组患者肝组织病理结果提示,显著性肝脏炎症和肝纤维化发生率较PNALT组和ALT1-2×ULN组的显著性增高(P值均<0.001)。4)伴PNALT的HBeAg阴性CHB患者(n=55)中,ALT≤0.5×ULN(n=23)与ALT0.5-1×ULN(n=32)两组比较,显著性肝脏炎症发生率无显著差异(0.0%vs15.6%,P=0.130),显著性肝纤维化发生率亦相似(17.4%vs40.6%,P=0.066)。患者按照40岁年龄进行分组分析,年龄≤40岁组(n=46)与年龄>40岁组(n=9)患者之间显著性肝脏炎症发生率无显著差异(10.9%vs0.0%,P=0.578),显著性肝纤维化发生率亦相似(30.4%vs33.3%,P=1.000)。若患者根据血清HBV DNA水平≤4log10copies/ml(n=50)与4-51og10copies/ml分组(n=5),两组患者之间显著性肝脏炎症与显著性肝纤维化发生率亦无显著性差异(6.0%vs40.0%,P=0.060;32.0%vs20.0%,P=0.963)。5)HBeAg阳性PNALT组(n=85),单因素回归分析显示无任何实验室指标与显著性肝组织学改变相关。ALT升高组(n=431),单因素回归分析结果提示年龄以及血小板(platelet,PLT)、凝血酶原活动度(prothrombin activity,PTA).白蛋白(albumin, ALB)、ALT、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和HBV DNA水平均与显著性肝脏炎症相关,而年龄以及PLT、ALB、 ALT、AST和HBV DNA水平则均与显著性肝纤维化相关。经多因素回归分析,显示年龄增加(OR=1.042[1.009-1.076],P=0.012)、AST升高(OR=1.015[1.008-1.022],P<0.001)和HBV DNA水平下降(OR=0.671[0.546-0.825],P<0.001)均与显著性肝脏炎症独立相关,而AST升高(OR=1.024[1.013-1.036], P<0.001)、HBV DNA (OR=0.685[0.530-0.885],P=0.004)和ALB水平(OR=0.933[0.877-0.992],P=0.027)下降则与显著性肝纤维化独立相关。6)HBeAg阴性PNALT组(n=55),单因素回归分析结果显示无任何实验室指标与显著性肝组织改变相关。ALT升高组(n=104),单因素回归分析结果提示PTA、ALB、ALT、AST和HBV DNA水平均与显著性肝脏炎症相关,而ALT、AST水平则与显著性肝纤维化相关。经多因素回归分析,提示仅AST水平升高与显著性肝脏炎症相关(OR=1.021[1.005-1.038],P=0.009)。7)对伴PNALT的]HiBeAg阳性CHB患者(n=96),依据Prati提出ALT的ULN分组,LT≤ULN组(n=40)与ALT>ULN组(n=56)患者之间比较显著性肝脏炎症与显著性肝纤维化发生率均无显著性差异(5.0%vs3.6%,P=1.000;47.5%vs50.0%,P=0.809)。将患者依据韩国提出ALT的ULN分组,ALT≤ULN组(n=64)与ALT>ULN组(n=32)患者之间比较显著性肝脏炎症与显著性肝纤维化发生率同样亦无显著性差异(4.7%vs3.1%,P=1.000；51.6%vs43.7%,P=0.470)。8)对伴PNALT的HBeAg阴性CHB患者(n=71),依据Prati发现ALT的ULN分组,ALT≤ULN组(n=46)与ALT>ULN组(n=25)患者之间比较显著性肝脏炎症与显著性肝纤维化发生率均无显著性差异(6.5%vs16.0%,P=0.388;39.1%vs40.0%,=0.943)。将患者依据韩国提出ALT的ULN分组,ALT≤ULN组(n=56)与ALT>ULN组(n=15)患者之间比较显著性肝脏炎症与显著性肝纤维化发生率同样亦相似(8.9%vs13.3%, P=0.984;41.1%vs33.3%,P=0.586)。9)HBV中前C/C基因启动子区不同位点变异在HBeAg阳性(n=148)与阴性(n=71)患者间发生率不同,T1753V、A1846T和G1896A变异在HBeAg阳性患者中发生率显著低于HBeAg阴性患者(分别为：10.1%vs19.7%,P=0.050、18.9%vs53.5%,P<0.001;20.3%vs36.6%,P=0.009),其他变异位点则无显著差异。前C/C基因启动子区不同位点变异在基因型B和基因型C之间发生率也不同,T1753V、A1762T/G1764A和C1766T/T1768A变异在基因型C感染者中的发生率显著高于基因型B感染者(分别为：22.4%vs4.5%,P<0.001;68.2%vs24.1%, P<0.001;10.3%vs0.0%, P<0.001),而G1896A变异发生率显著低于基因型B感染者(15.0%vs35.7%,P<0.001)。10) HBeAg阳性患者(n=148)中,单因素回归分析结果提示基因型C、A1762T/G1764A变异和A1846T变异与显著性肝脏炎症相关,而A1762T/G1764A变异、G1896A变异则与显著性肝纤维化显著相关。经多因素回归分析,A1846T变异与显著性肝脏炎症独立相关(OR=5.360[2.084-13.787], P<0.001),而A1762T/G1764A (OR=7.098[2.497-20.177],P<0.001)、G1896A变异(OR=16.816[2.150-131.553],P=0.007)则与显著性肝纤维化独立相关。HBeAg阴性患者(n=71)中,单因素回归分析结果提示仅A1762T/G1764A变异(OR=4.296[1.092-16.898], P=0.037)与显著性肝脏炎症相关,而年龄、性别、基因型和其他位点变异与显著性肝组织学改变均无显著相关性。11)将CHB患者分为四种不同BCP/PC变异模式,即BCP-/PC-(n=83)、 BCP+/PC-(n=80)、BCP-/PC+(n=36)和BCP+/PC+(n=20)(BCP: A1762T/G1764A;PC:G1896A;+代表变异阳性；-代表变异阴性)。AST水平在四种不同BCP/PC变异模式间存在显著性差异,其中在BCP+/PC-组与BCP-/PC+组中的水平均较BCP-/PC-组的显著升高(P=0.002与P=0.020)。四组间HBV DNA水平无显著差异,然而当中BCP+/PC+组HBVDNA水平较BCP-/PC-组显著下降(6.13±1.091og10copies/ml vs6.69±1.80log10copies/ml,P=0.027)。而]BeAg阴性率在BCP-/PC-组中最低(24.1%),其次为BCP+/PC-组(31.3%),再次为BCP-/PC+组(33.3%),在BCP+/PC+组中阴性率最高(70.0%),四组间比较差异有统计学意义(P=0.001)。12)HBeAg阳性CHB患者(n=148)中显著性肝纤维化发生率在四种BCP/PC变异模式之间具有显著性差异(P<0.001)。其中伴显著性肝纤维化组(n=116)中将近70%患者存在BCP和／或PC变异,而伴轻度肝纤维化组(n=32)中超过80%患者BCP和PC变异均为阴性。148例HBeAg阳性患者中17例患者伴ALT≤ULN,BCP和／或PC变异诊断该类患者显著性肝纤维的敏感性、特异性、阳性预测值与阴性预测值分别为70%、100%、100%和70%。结论：1)伴PNALT的CHB患者显著性肝纤维化并不罕见,对于该类患者强烈推荐进行肝纤维化程度评估,特别是伴PNALT且年龄大于30岁的HBeAg阳性患者。2)显著性肝纤维化在伴ALT轻度升高的CHB患者中较常见。3)Prati以及韩国修改ALT的ULN并不能反映伴PNALT的CHB患者显著性肝组织异常的发生,因此其或许并不适用于中国CHB患者。4)HBeAg阳性CHB患者中,前C/C基因启动子区的A1846T变异与患者显著性肝脏炎症发生相关,A1762T/G1764A、G1896A变异则与显著性肝纤维化相关。5) HBeAg阴性CHB患者中,前C/C基因启动子区的A1762T/G1764A变异与显著性肝脏炎症相关。6)A1762T/G1764A和/或G1896A变异诊断对伴ALT正常HBeAg阳性患者的显著性肝纤维化可能具有较高诊断效能。