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目的:探讨兔脂肪干细胞(rabbit adipose-derived stem cells,rASCs)的生物学特性及其复合多孔支架材料聚羟基乙醇(PLGA)的生物相容性。在此基础上,进一步探讨以自体、异体rASCs 作为种子细胞分别复合PLGA 支架材料构建组织工程角膜基质修复角膜基质层缺损的可行性,评价其修复效果并探讨作用机制,为角膜组织工程种子细胞和生物支架材料的研究提供实验依据。
方法:(1)采用消化法分离培养兔脂肪干细胞,传至第四代验证其多向分化功能。(2)荧光染料DiO 标记第四代脂肪干细胞并将其接种于多孔PLGA 支架,hoechst 法定量检测细胞在支架上的生长情况,并分别于接种后第1,3,7 天对细胞-生物材料复合物行共聚焦显微镜和扫描电镜检测,观察细胞在该支架上的粘附生长和细胞外基质分泌情况。(3)腺病毒转染绿色荧光蛋白(green fluoresence protein, GFP)标记兔脂肪干细胞,示踪细胞的转化转归。构建兔角膜基质缺损模型,自体和异体rASCs-PLGA 复合物体外培养7 天后分别回植到相应角膜基质缺损模型的角膜基质层间,术后第12 周和24 周取材行大体观、组织学和透射电镜超微结构观察比较修复效果。单纯缺损不加移植物组和未接种细胞的PLGA 材料移植组作为对照组。(4)荧光显微镜检测自体和异体rASCs-PLGA 组角膜基质层间GFP 的表达,免疫荧光检测相应部位角膜基质细胞特异性蛋白多糖keratocan 和胞浆蛋白ALDH1A1 的表达。
结果:(1)体外培养的第四代rASCs 具有成骨,成脂,成软骨等多向分化功能。(2)细胞接种至PLGA 支架材料上增殖明显,第7 天细胞生长达到平台期,扫描电镜和共聚焦显微镜检测显示细胞在支架上贴附生长良好,能够在支架表面及孔隙内壁得到充分伸展和生长,细胞外基质分泌旺盛。(3)体内实验中自体rASCs-PLGA 组移植术后12 周材料降解,角膜基本恢复透明,异体rASCs-PLGA 组术后24 周仍未恢复透明。组织学检查显示移植术后24 周自体rASCs-PLGA 组新生角膜基质样组织与正常角膜基质组织相似,异体rASCs-PLGA 组仍有明显缺损区域存在。电镜下胶原纤维直径比较显示,各组术后24 周胶原直径均较12 周时均一、排列也趋于整齐,自体rASCs-PLGA 组角膜基质胶原直径纤维排列与正常角膜基质最为相似,异体组次之。(4)荧光显微镜下可见自体rASCs-PLGA 组和异体rASCs-PLGA组角膜基质层间均有GFP阳性细胞表达,自体组多于异体组。免疫荧光检测显示自体和异体组植入的细胞表达角膜基质细胞特异性蛋白多糖keratocan 和胞浆蛋白ALDH1A1。
结论:体外培养的兔脂肪干细胞具有多向分化功能,与多孔PLGA支架具有良好的生物相容性,作为种子细胞来源可以构建出具有良好组织学结构的组织工程角膜基质用以修复角膜基质缺损,且自体细胞修复效果优于异体细胞。植入脂肪干细胞在体内微环境诱导下向角膜基质细胞表型转化,为脂肪干细胞多向分化功能提供了新的实验依据。