前言 钙离子(Ca²⁺)是细胞内最普遍而重要的信号转导成分，细胞内钙离子浓度([Ca²⁺]_i)的变化在调控细胞的基因转录，DNA合成、DNA修复以及有丝分裂等一系列生理病理过程中起着重要作用，与细胞增殖、基因突变以及肿瘤细胞的发生发展密切相关。研究表明，低Ca²⁺易诱发恶性肿瘤，维生素D₃（VD₃）一方面作为促进钙吸收的活性物质，通过与钙的协同效应发挥抗肿瘤作用；另一方面，VD₃通过与维生素D受体（VDR）的结合，改变基因转录的速度，从而调节细胞的增生、分化和凋亡。本实验研究拟通过四甲基唑盐比色法（MTT）及同位素放射自显影法（ARG）检测Ca²⁺及VD₃对人宫颈癌细胞增殖的影响，探讨Ca²⁺和VD₃在宫颈癌细胞增殖过程中的调控作用。 材料与方法 1．实验材料 人宫颈癌细胞株Hela细胞为中国医科大学细胞生物实验室惠赠；人宫颈癌组织取材于中国医科大学附属第一医院妇产科；³H-TdR，原子核乳胶购于中国原子能研究所；HPMI1640培养基购于life technology USA；96孔培养板、MTT、胰酶购于华美生物工程公司；新生小牛血清购于天津生化制品厂。其它试剂均达分析纯。 2．实验方法 2．1 细胞实验部分 Hela细胞株在含10％小牛血清的RPMll640培养液中（内含0．1％青霉素、链霉素）培养并置于 5％CO卜95％空气＊7℃孵箱内，待细胞长满后，用 0．25％胰酶消化，传代培养。将 Hela细胞制成 lx 10’cells／Inl细胞悬液，置 96孔培养板内，100冲孔，，37℃，5％CO。条件下培养24 ／J’时，进行下述实验。实验分为：不同 Ca卜浓度处理组；VD。处理组；Cak与VD。协同处理组；维拉帕米（VP）与 Ca人共同作用组JP与 VD。及 Caz”共同作用组等实验组，同时设立空白对照组。对照组只加人RPMll640培养液，最后使各孔的终体积相等。37t下继续培养，分别在培养的6在4／8＊2小时后加人 ig／L的 MrIT；20wIL，继续培育4小时，弃去培养液，加入二甲基亚现，＊0卜V孔，微振荡15分钟，置酶标仪上，在波长为490urn时测吸光度则D)值。 2．2 临床标本实验部分 在无菌条件下取新鲜的宫颈癌组织快速放人4℃含RP－Mll640培养液的平M中，在 5分钟内将材料分切成 lx 3nun的小块。将标本放人含10％小牛血清RPMll640培养液的培养皿中继续培养。实验分组为：肿瘤细胞对照组；高 Ca厂作用组；VD。作用组；高 Ca卜十VD3组；Ca卜通道阻滞组 1：VP＋Ca卜；Ca卜通道阻滞组人VP＋Caz”＋VD如对照组为单纯 nyMll640培养液，最后使各平皿中溶液的终体积相等。将培养皿置于 5％CO卜95％空气。37℃孵箱内，培养72小时。将各培养皿中的液体及标本收集于小瓶中，并做好标记，向各小瓶中加人’H－TdR人 pCirlnl，将小瓶放人37t恒温箱内的磁力搅拌器上，缓慢搅拌90分钟，取出小瓶后去掉上清液，在常温下用10nd不含小牛血清的培养液冲洗三次。经梯度酒精脱水、浸腊、包埋、切片制成 7 pm的石蜡切片，暗室内涂乳胶，放人4℃冰箱内曝光ZI天，经显影、定影＼染色＼封片后于显微镜下观察细胞标记情况。在各组切片中，随机取5个视野，计数每100个细胞中标记细胞的个数。 ·二· 结 果 1．M’IT比色法检测不同药物对Hela细胞增殖的影响 各组药物作用于Hela细胞6 ／J’时后对其增殖的影响与对照组相比无统计学意义；而作用24 ／J’时后，10mM，20mM的h‘均使细胞的生长速度减慢，抑制率分别为10％，15％；随着作用时间的延长，进一步抑制其生长速度；72h后，10mM在0mM的Cak对He－la细胞的抑制率分别达15％30％。而ZInM的Cah在各个时间点对Hela细胞的生长速度均无显著影响。加 VD。于各浓度的Ca卜中，作用于 Hela细胞，24小时后，Hela细胞的生长速度减慢，抑制率分别为5％在0％J4％，且随着作用时间的延长，抑制率增加，72 ／J’时后各组的抑制率分另为12％J2％j4％。Ca卜对Hela细胞增殖的抑制作用具有浓度、时间依赖性，VD。对其有协同效应。VP可桔抗hh对Hela细胞增殖的抑制作用，而对VD。的作用不明显，提示外钙内流是高钙引起的抑制细胞增殖作用的一个主要途径，而VD3起的抑制细胞增殖的作用则与外钙内流不甚相关，提示可能有其它机制的参与。 2．同位素放射自显影检测不同药物对宫颈癌组织细胞标记率的影响 如照片所示，与对照组（Pie．l）相比，20mM Ca八（Pie．2）可使细胞的标计率下降，但100nM VD／Pie．3你对细胞的标记率无显著的影响，但可促进 20mM Cah的作用，与 CaZ”协同进一步使细胞的标记率下降瞩．4人 如图H．5所示JP可桔抗 Cak降低细胞标记率的作用，使之与对照组相比较无显著差别，说明高钙引起的外钙内流作用被VP阻断后其抑制细胞增殖的作用随之被取消，若 VP与 Ca人及VD。同时作用，则VP不能完全阻龈者引起的抑制细胞增殖的作 ·3·用，说明 VD。协同