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目的:多药耐药是子宫内膜癌化疗失败的主要原因之一,子宫内膜癌耐药性的研究大多集中在单个或少数几个相关基因及其蛋白质产物上,因此我们从蛋白质整体入手,利用差异蛋白质组学研究方法,比较子宫内膜癌耐药细胞B-MD-C1(ADR+/+)与非耐药细胞B-MD-C1的蛋白质表达谱,识别和鉴定差异表达蛋白,分析差异蛋白与其耐药的关系,为子宫内膜癌耐药机制及其逆转的研究开辟新的思路、提供新的线索,为临床选药、评估病人疗效以及寻找新的药物治疗靶标提供理论据。
方法:
1：采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)的耐药倍数,是否符合实验条件。
2：培养子宫内膜癌耐药细胞B-MD-C1(ADR+/+)和非耐药细胞B-MD-C1,应用超声破碎法提取其总蛋白。
3：应用双向凝胶电泳技术获得子宫内膜癌耐药细胞B-MD-C1(ADR+/+)和非耐药细胞B-MD-C1的2-DE图谱,采用PD-quest7.0软件进行匹配和差异分析,识别两组之间表达差异蛋白点。
4：从胶中切取差异蛋白点进行胶内脱色和原位酶解,酶解产物进行MALDI-TOF-MS分析,获得肽质量指纹图,数据库搜索鉴定蛋白质。
5：应用Western Blot方法检测其中3个差异表达蛋白在子宫内膜癌耐药细胞B-MD-C1(ADR+/+)和非耐药细胞B-MD-C1的表达,观察它们在两组细胞中的表达是否与蛋白组学方法检测结果一致。
结果:
1：ADM对B-MD-Cl(ADR+/+)和B-MD-C1细胞的半数抑制浓度IC50分别为21.57±0.77μg/ml和2.32±0.34μg/ml,B-MD-C1(ADR+/+)细胞耐药倍数约为B-MD-C1细胞的9.3倍,两者具有非常显著差异(p＜0.01)。
2：建立了分辨率高,重复性好的子宫内膜癌耐药细胞B-MD-C1(ADR+/+)与非耐药细胞B-MD-C1的双向凝胶电泳图谱。
3：在两株细胞系之间识别了35个差异表达的蛋白质点。与B-MD-C1细胞相比,B-MD-C1(ADR+/+)细胞有18个蛋白点表达上调(相差2倍以上),其中上调10倍以上的蛋白点有5个;17个蛋白点表达下调(相差2倍以上),其中下调10倍以上的蛋白点有3个。
4：从2-D胶中切取35个差异表达的蛋白质点进行质谱鉴定及数据库查询。结果有24个蛋白质点得到鉴定。这些差异表达蛋白质的功能涉及细胞信号转导、构成细胞骨架蛋白、代谢酶类、细胞周期相关蛋白、参与糖酵解及肿瘤药物代谢等。
5：应用Western blot法对B-MD-C1(ADR+/+)和B-MD-C1细胞中β-微管蛋白多肽、α-烯醇酶和热休克蛋白的表达进行了验证。结果显示,β-微管蛋白多肽和α-烯醇酶在B-MD-C1(ADR+/+)细胞中表达下降,与对照组比较具有显著性差异(p＜0.05);热休克蛋白表达升高与对照组比较具有显著性差异(p＜0.05),应用Western blot法与蛋白质组学所得结果一致。
结论:
1：应用双向电泳技术获得了重复性良好的子宫内膜癌B-MD-C1细胞株与子宫内膜癌耐药B-MD-C1(ADR+/+)细胞株的双向电泳凝胶图谱,二者存在明显差异。
2：应用MALDI-TOF-MS技术,成功鉴定了20多种差异蛋白质点。
3：热休克蛋白、β-微管蛋白、丙酮酸激酶同工酶、核糖体蛋白和α-烯醇酶等蛋白与B-MD-C1(ADR+/+)细胞耐药密切相关,可进行下一步蛋白质功能的研究,为子宫内膜癌耐药机制的进一步研究提供理论依据和研究线索。