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1.目的溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）是一种高度进行性炎性疾病,常常伴随体重减轻、腹痛、腹泻、便血等症状,严重影响了患者的生活质量。对能够改善UC症状的膳食补充剂或天然产物的开发越来越受到关注。穿心莲内酯（Andrographolide,AND）是从中药穿心莲中提取出来的二萜内酯类化合物,具有良好的抗炎活性。因此,AND有望开发为新型治疗溃疡性结肠炎的药物。但AND水溶性差,在上消化道中的稳定性差,生物利用度低。因此,本课题拟设计结肠递药系统,提高AND的体内稳定性,使AND结肠部位的浓度提高,从而增强抗结肠炎的药效。2.方法2.1穿心莲内酯治疗大鼠溃疡性结肠炎的药效学研究以噁唑酮（Oxazolone,OXZ）为造模剂构建大鼠UC模型,考察不同剂量的AND对大鼠UC的改善作用。通过大鼠结肠损伤指数（Disease activity index,DAI）、结肠长度、脾脏系数等方面初步评估AND对UC的疗效。同时,借助病理分析、免疫组化分析、炎症因子检测及western blot等手段进一步探讨AND改善UC的作用机制。2.2负载穿心莲内酯的琥珀酸-ε-聚赖氨酸介孔二氧化硅纳米粒的制备与表征首先,以聚赖氨酸（ε-polylysine,EPL）与琥珀酸（Succinic anhydride,SA）为原料,合成琥珀-ε-聚赖氨酸（Succinylatedε-Polylysine,SPL）,采用核磁共振、凝胶渗透色谱及马尔文粒度分析仪等对SPL进行表征。其次,采用模板法制备经典介孔二氧化硅纳米粒,采用刻蚀法制备中空介孔二氧化硅纳米粒。在1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（1-Ethyl-3-（3-dimethlaminopropyl）carbodiimide,EDC）与N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide,NHS）的催化下,将SPL连接到MSNs的表面,制备琥珀-ε-聚赖氨酸介孔二氧化硅纳米粒（SPL-MSNs）。采用透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）、红外光谱法、热重分析法、马尔文粒度分析仪、全自动比表面积测定仪等对所制备的MSNs载体进行表征。此外,采用溶血试验、蛋白吸附试验及细胞毒性试验考察所制备MSNs的体外生物相容性。最后,分别采用吸附法、吸附/减压蒸发法、减压吸附/溶剂挥发法进行载药实验,确定最佳载药方法,并对所制备的负载穿心莲内酯的琥珀-ε-聚赖氨酸介孔二氧化硅纳米粒（AND@SPL-MSNs）进行体外释药试验。2.3负载穿心莲内酯的琥珀酸-ε-聚赖氨酸介孔二氧化硅纳米粒的药效学及药动学研究以OXZ为造模剂构建大鼠UC模型,考察AND@SPL-MSNs对大鼠UC的改善作用。通过大鼠DAI、结肠长度、脾脏系数等方面初步评估AND对UC的疗效。借助病理分析、免疫组化分析、免疫荧光分析及炎症因子检测等手段进一步探讨AND@SPL-MSNs改善UC的作用机制。此外,取动物的心、肝、脾、肺、肾进行病理分析,考察AND@SPL-MSNs的体内安全性。单剂量给予UC模型大鼠AND与AND@SPL-HMSNs,考察给药2、4、6、8、12、24 h后,AND在胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结直肠的分布情况,以评价AND@SPL-HMSNs是否能够增加AND在结肠部位的药物浓度。此外,采用药动试验验证AND@SPL-HMSNs是否能够增加AND的血药浓度。3.结果3.1穿心莲内酯治疗大鼠溃疡性结肠炎的药效学研究当剂量为80 mg·kg-1时,AND对OXZ诱导的UC具有显著地改善作用。与Model组相比,给予AND治疗后,大鼠DAI与死亡率降低,结肠缩短程度及脾肿大程度得到改善。病理结果表明,AND可以使结肠结构基本恢复正常,减少炎症细胞浸润。AND可以降低MPO、TNF-α、IL-4与IL-13在结肠组织中的表达量。Western blot检测结果表明,AND可通过抑制IL-4与IL-13的分泌来阻止IL-4/IL-13与IL-4R的特异性结合,从而阻断级联反应的发生,抑制STAT6活化,干扰炎症反应的进行。3.2负载穿心莲内酯的琥珀酸-ε-聚赖氨酸介孔二氧化硅纳米粒的制备与表征核磁共振的结果表明,SA中羧基与EPL中氨基发生酰化反应,成功合成了SPL,分子量为20693。SPL在p H1.2、p H5.5、p H7.5的缓冲溶液中Zeta电位梯度改变,提示其具有一定的p H响应性。所制备的纳米粒均为球形,且粒径均一,介孔孔径在2～4 nm,比表面积大。SPL-MCMs与SPL-HMSNs所包裹的SPL的厚度约为10～13 nm。SPL-MCMs与SPL-HMSNs具有良好的生物可降解性与生物相容性。细胞摄取实验表明,SPL-HMSNs可被细胞摄取,提示其可用于细胞内递药。载药方法确定为减压吸附/溶剂挥发载药法,AND@SPL-MCMs与AND@SPL-HMSNs的载药量分别为27%,32%,包封率分别为54%,64%。体外释药研究结果表明,所制备的AND@SPL-MSNs具有一定的结肠定位释药的作用,且24 h内AND@SPL-HMSNs释药量大于AND@SPL-MCMs。释放动力学研究表明,释放过程均符合Riger-Peppas动力学模型,且动力学系数k在0.82～0.85,说明AND的释放是药物扩散与载体骨架溶蚀共同作用的结果。对所制备制剂的理化参数、体外稳定性、体外相容性、载药量、包封率及体外释药特性等实验结果进行综合分析发现,与SPL-MCMs相比,SPL-HMSNs更适合作为结肠递药的载体。3.3负载穿心莲内酯的琥珀酸-ε-聚赖氨酸介孔二氧化硅纳米粒的药效学及药动学研究由DAI、结肠长度、脾脏系数、病理结果及炎症因子表达量结果可知,AND@SPL-HMSNs对大鼠UC的改善作用略优于AND或AND@NH2-HMSNs。免疫组化实验结果表明,AND与AND@SPL-HMSNs可抑制NF-κB与STAT6的活化,从而抑制炎症反应的进行。免疫荧光实验结果表明,AND与AND@SPL-HMSNs可抑制巨噬细胞与肥大细胞的增殖,减少炎症介质的释放,从而发挥抗炎的作用。免疫组化与免疫荧光实验结果均表明AND@SPL-HMSNs抗炎作用优于AND。连续5天给予AND@SPL-HMSNs不会造成心、肝、脾、肺及肾等器官的损伤。由此推测,短期内控制好SPL-HMSNs的给药剂量,其体内安全性良好。体内组织分布实验表明,AND@SPL-HMSNs可成功提高盲肠与结肠局部AND药物浓度,而药动试验结果表明,AND@SPL-HMSNs可以提高AND的生物利用度。4.结论AND可通过抑制STAT6的活化发挥治疗UC的作用,提示AND有望开发为新型治疗UC的药物。本课题成功制备了SPL-HMSNs结肠递药系统,具有可结肠定位释药、载药量高、生物可降解、体外生物相容性好、体内安全性好等优点,为结肠给药新制剂的开发提供理论依据。