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黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)作为广泛分布于食物和饲料中的有毒有害小分子物质,严重威胁着人类和动物的健康,主要表现为肝肾脏损伤、致畸致癌。由于纳米抗体具有体积小、高稳定性、良好水溶性、便于改造遗传信息等特性,食品安全领域已经广泛应运纳米抗体作为靶标的示踪物。具有简便、经济、快速的免疫层析试纸条广泛应运于真菌毒素的检测方面,实现多种毒素的同时检测以及高灵敏度的检测成为我们需要解决的问题。均相的能量共振转移(Fourier transform infrared spectroscopy,FRET)技术,通过控制荧光供体与荧光受体之间的有效光谱重叠、空间距离、偶极取向而发生能量转移,以荧光信号作为输出信号实现对靶标的检测,FRET较常规的检测方法具有更高的灵敏度。通过选择合适的供体与受体,优化FRET体系影响因素提高灵敏度。本研究通过表达纯化抗AFB1和OTA的纳米抗体,研制针对AFB1和OTA的双重检测试纸条;构建重组表达载体,表达抗OTA纳米抗体与黄色荧光蛋白偶联蛋白,与靶标竞争物偶联的纳米金作为荧光受体,建立FRET体系。具体研究如下:1同时检测OTA和AFB1双重免疫层析试纸条的研制通过将重组表达载体pET-CTB-VHH28和pET-CTB-G8转入大肠杆菌进行表达,得到五价的CTB-VHH28,分子量约为150 KDa,通过间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA,Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)测蛋白活性检测蛋白及灵敏度,IC50为0.68 ng/mL;表达的单价纳米抗体CTB-G8,分子量约为30 KDa,通过间接竞争ELISA测定蛋白活性和灵敏度,IC50为1.97 ng/mL。制备粒径为56 nm的AuNFs,通过在NC膜上固定OTA-BSA、AFB1-BSA和Anti-His-mAb制备检测OTA和AFB1的双重检测试纸条。分别优化了 CTB-G8和Anti-CTB-mAb与AuNFs偶联的最佳pH,Anti-CTB-mAb与CTB-VHH28添加的最佳比例,CTB-G8的最佳添加量,金探针 AuNFs@anti-CTB mAb@CTB-VHH28 和 AuNFs@CTB-G8 最优添加量,OTA-BSA 和 AFB1-BSA 最佳固定量。针对 OTA 的 IC50 为 0.378 ng/mL,LOD 为0.0957 ng/mL;针对 AFB1的 IC50 为 1.541 ng/mL,LOD 为 0.184 ng/mL。制备纳米抗体代替传统单克隆抗体,以及具有凹凸、巨大比表面积的花状纳米金,实现了同时对AFB1和OTA两种毒素的高灵敏度检测。2基于抗OTA特异性荧光纳米抗体和AuNPs的FRET体系的建立表达荧光蛋白VHH28-YFP作为荧光供体,结合MNPs制备能量受体探针MNPs@Cys@AuNPs@OTA-BSA,优化了 Cys 最佳偶联量、AuNPs 添加量、OTA-BSA最佳偶联量、VHH28-YFP最佳投入量。通过计算猝灭效率E,建立FRET体系的标准曲线,LOD为8.05 pg/mL。结果表明,均相的FRET具有较常规检测方法更高的灵敏度。