研究背景与研究目的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种肺实质损伤性疾病,为弥漫性炎症损伤,由多种炎性介质与免疫细胞发挥协同作用,最终导致级联放大的炎症性瀑布反应。除肺实质细胞如内皮细胞及上皮细胞外,局部浸润的炎症细胞,如中性粒细胞及单核巨噬细胞等均在急性肺损伤的病理生理过程中发挥重要作用。此外,在急性肺损伤的发病过程中,肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophage,AM)通过多种机制可发挥促炎和抑炎的双重作用。感染是儿童急性肺损伤的首要病因,其中,细菌和病毒感染居首位。细菌感染尤其是脓毒血症导致的儿童急性肺损伤的发病机制研究较多,如各种炎性因子和炎性细胞、NF-κB信号通路、cfDNA等,但病毒感染导致的急性肺损伤发病机制尚未阐明,尤其是感染后肺泡巨噬细胞参与急性肺损伤的具体机制尚不明确。AM受各种因素刺激后能分泌多种炎性因子及趋化因子,诱导中性粒细胞在微血管内聚集、滞留,从而黏附于血管内皮细胞表面,同时释放各种炎性介质及细胞毒性分子,对肺泡毛细血管结构造成损伤,引发肺水肿,是ALI炎症反应损伤的重要机制。肺部炎症是通过趋化因子CCL3刺激单核细胞和肺泡巨噬细胞所介导的,CCL3与相应受体特异性结合后产生瀑布样细胞活化作用。CCL3的受体有CCR1、CCR5和CCR9,均属于G蛋白偶联受体。而且,Soehnlein等研究发现,CCR5对募集单核/巨噬细胞具有重要作用。表观遗传修饰为巨噬细胞的分化和极化过程提供了独特的转录谱,决定了不同巨噬细胞亚群的迁移活性和功能。JMJD超家族(JHDMs)属于组蛋白去甲基化酶,包括JMJD1A,JMJD1C,JMJD2A,JMJD3等,它们均可选择性催化组蛋白的去甲基化修饰,从而调节基因转录活性、染色体结构以及染色质损伤修复等。有研究表明,在LPS作用的巨噬细胞中,组蛋白去甲基化酶JMJD3表达上调,使H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)水平下调进而调控下游基因转录,并预测JMJD3可能与约70%的LPS诱导基因发生相互作用。然而,病毒及其相关产物对巨噬细胞的表观遗传修饰作用目前所知甚少。肺泡巨噬细胞的募集在急性肺损伤的发病过程中发挥重要作用,病毒感染极大的促进了这一细胞群体在肺部的聚集。为了研究巨噬细胞活化在急性肺损伤中的作用及其内在机制,本研究第一部分通过分析病毒产物poly I:C对THP-1来源巨噬细胞趋化因子表达及巨噬细胞趋化活性的影响,并集中研究了含Jumonji C结构域的组蛋白去甲基化酶(JHDMs)在这一过程中的作用及调控机制,进而解析病毒感染后巨噬细胞活化、募集促进急性肺损伤的机制。第二部分通过建立病毒性急性肺损伤动物模型检测相应趋化因子及受体的表达,验证肺泡巨噬细胞活化在病毒性急性肺损伤中的作用及机制。研究方法与研究结果1.第一部分:polyI:C作用下巨噬细胞趋化活性和CCR5表达及其TLR3/JMJD1A信号通路的研究。该部分研究所用的实验技术主要为:细胞培养和处理,流式细胞术检测,RNA提取与逆转录,real-time PCR,siRNA转染,巨噬细胞迁移实验,染色体免疫共沉淀(ChIP),Western blot 等。(1)poly I:C作用的THP-1来源巨噬细胞趋化因子受体谱的表达:通过real-time PCR方法检测poly 1:C作用下,THP-1单核细胞及单核细胞来源巨噬细胞中CCR1、CCR4、CCR5及CCR6的表达水平,结果显示THP-1来源巨噬细胞中CCR5的表达水平显著上调,THP-1单核细胞中CCR5 mRNA无明显变化。poly I:C作用的单核细胞或单核来源巨噬细胞中CCR1,CCR4和CCR6 mRNA的表达水平均无显著变化。我们进一步通过流式细胞术证实了 poly I:C作用的单核来源巨噬细胞表面CCR5的表达显著上调(poly I:C组:45.9%;对照组 20.8%)。巨噬细胞通过TLR3信号通路识别poly I:C刺激。我们敲除了 THP-1来源巨噬细胞中TLR3的表达后,poly I:C作用引起的CCR5 mRNA表达上调被明显抑制。因此,polyI:C促进CCR5表达是通过TLR3信号通路实现的。(2)poly I:C通过TLR3信号通路促进THP-1来源巨噬细胞对CCL3的趋化活性:CCL3是CCR5的配体之一。为了研究poly I:C是否通过CCL3/CCR5轴促进THP-1来源巨噬细胞的迁移,我们建立了transwell细胞迁移模型,上室分别加入对照或poly I:C作用的巨噬细胞,下室加入人重组CCL3(rhCCL3)。对照组巨噬细胞可向rhCCL3迁移,而poly I:C刺激进一步促进巨噬细胞向rhCCL3的迁移活性。此外,敲除polyI:C作用的单核来源巨噬细胞中TLR3表达后,其对rhCCL3的迁移活性显著降低。(3)poly I:C作用的巨噬细胞中JHDM家族成员表达测定结果:通过real-time PCR分别检测了对照组及poly I:C作用的巨噬细胞中23种JHDM家族成员的表达水平,poly I:C 显著上调 JMJD1A,JMJD1C,JMJD2A,JARID1A 及 HSPBAP1 的表达,其中JARID1A的上调幅度最大(3.65±0.45倍)。从上述结果中我们发现,JMJD1A和JMJD1C在巨噬细胞中含量较高,且polyI:C显著促进二者的表达。将对照组和poly I:C作用组的TLR3敲除后,结果显示TLR3敲除显著抑制polyI:C对THP-1来源巨噬细胞中这两种组蛋白去甲基化酶的上调作用。因此,在接下来的研究中,我们选择这两种JHDMs亚家族成员作为研究对象。(4)polyI:C调节的JMJD1A通过影响组蛋白去甲基化作用调控CCR5的表达:为探究JMJD1A和JMJD1C是否参与调控CCR5的表达,我们在对照组及poly I:C作用组的巨噬细胞中分别敲除JMJD1A和JMJD1C,结果显示JMJD1A敲除在对照组和polyI:C作用组巨噬细胞中均导致CCR5的显著下调,而JMJD1C的作用无统计学意义。流式细胞术进一步证实了 JMJD1A敲除对CCR5表达的下调作用。组蛋白去甲基化酶JMJD1A可调控H3K9me2的水平。因此,我们进一步探究JMJD1A对CCR5表达的调节作用是否依赖于其对H3K9甲基化状态的调节。结果显示,poly I:C促进H3K9me2表达较大程度的下调,而H3K9me3表达水平无明显变化。JMJD1A敲除可在对照组巨噬细胞中导致H3K9me2表达上调,但在poly I:C作用的巨噬细胞中无明显变化。我们又进一步验证polyI:C作用对CCR5启动子区甲基化水平的作用。通过ChIP-qRT-PCR实验分析CCR5上游启动子区组蛋白H3K9me2的状态,结果显示poly I:C显著抑制CCR5启动子区H3K9me2的表达水平,进而促进其表达。2.第二部分:病毒性急性肺损伤小鼠模型验证肺泡巨噬细胞相应活化机制。将40只4周龄体重13g-15g SPF级雄性BALB/c小鼠,随机分为4组(实验组T1和T2,对照组Cn1和Cn2),T1、T2组小鼠采用polyI:C经口咽吸入气管,Cn1和Cn2给予相同方法吸入同等量的生理盐水。定时称量T1和Cn1组小鼠的体重,观察并记录小鼠存活状态,连续观察15天。T2组和Cn2组在处理后第6天做动脉血气分析,进行支气管肺泡灌洗,取灌洗液离心,用ELISA法测支气管肺泡灌洗液上清液中CCL3、TNF-α、IL-1β、IL-6的表达;离心后的沉淀细胞用培养基培养,收集并提纯肺泡巨噬细胞,通过实时定量PCR方法检测肺泡巨噬细胞中CCR5、TLR3、JMJD1A的水平。取肺组织测量肺指数(肺指数=肺湿重/体重X 100%)、肺湿千重比(W/D=肺湿重/肺干重),肺组织切片HE染色观察组织病理改变并病理损伤评分。(1)poly I:C处理过的T1、T2组小鼠逐渐出现精神萎靡、活动减少、觅食下降、呼吸频率加快、皮毛松乱等,体重呈下降趋势。polyI:C处理后第6天开始有小鼠出现死亡,15天内有7只小鼠死亡。解剖可见肺部水肿、淤血和出血,支气管内流出血性泡沫样液体。生理盐水吸入组小鼠未见明显异常。(2)poly I:C处理后第6天实验组T2的Pa02、Sa02较对照组Cn2均显著下降(P<0.01),实验组T2的PaC02较对照组Cn2显著上升(P<0.05),实验组T2 PH值与对照组Cn2相比差异不明显(P>0.05)。polyI:C处理后第6天Cn2组平均肺指数(0.66±0.02),T2组平均肺指数(1.98±0.06),T2组显著高于Cn2组(P<0.01)。实验组T2的W/D值均高于Cn2组(P<0.01)。(3)两组小鼠肺组织切片HE染色病理损伤评分结果:T2组小鼠肺泡壁水肿、增厚,肺泡腔变小,肺间质疏松水肿;肺组织出血,肺泡腔及间质内有大量红细胞。Cn2组小鼠肺组织结构无正常。T2组小鼠肺组织的病理损伤评分(5.76±0.51)明显高于对照组(1.47±0.23),差异有统计学意义(P<0.01)。(4)T2组小鼠肺泡灌洗液中CCL3、TNF-α、IL-1p、IL-6的表达较Cn2组显著增加(P<0.01)。T2组小鼠肺泡巨噬细胞CCR5、TLR3、JMJD1A mRNA表达较Cn2组显著上调(P<0.01)。结论1.polyI:C通过TLR3促进巨噬细胞中CCR5的表达,进而促进其对CCL3的趋化活性。这一过程通过JMJD1A的表达上调实现,后者抑制H3K9me2与CCR5启动子区的结合,从而增强CCR5编码基因的转录活性。2.polyI:C处理后的病毒性急性肺损伤小鼠模型造模成功,提示病毒感染所致急性肺损伤与炎症损伤及巨噬细胞活化相关,体内验证了肺泡巨噬细胞募集是通过TLR3/JMJD1A信号通路促进CCR5的表达及其趋化活性所致。