论文部分内容阅读
【目的】探讨软骨细胞外基质支架制备工艺的改进以及其优越性。【方法】(1)应用目前的匀浆-脱细胞方法制作软骨细胞外基质(extracellular matrix,ECM)粉末,在此基础上使用高速研磨仪通过反复冷冻研磨,最后经过颗粒筛选获得更加细腻的粉末,我们称其为改良ECM粉末(fine extracellular matrix,FECM)。(2)将ECM粉末和FECM粉末分别以10%(w/v)浓度通过冷冻干燥法制成ECM支架和FECM支架。(3)分别对ECM支架和FECM支架进行大体观察,扫描电镜(SEM)检测其微观结构,并测量其孔径。(4)对两种支架进行DAPI染色观察脱细胞情况,孔隙率及吸水率测定、CCK-8细胞毒性实验等相关检测。(5)在两种支架上分别接种第3代骨髓间充质干细胞(BMSCs),分别计算细胞接种率和粘附率。(6)将ECM支架和FECM支架分别作为对照组和实验组。并应用聚乳酸聚羟基乙酸聚合物(PLGA)支架为阳性对照组。取等量第3代骨髓间充质干细胞(BMSCs)种植于ECM支架和FECM支架,同时将等量经过成软骨诱导的BMSCs种植于PLGA支架,然后将三种细胞-支架复合物移植入裸鼠皮下。28天后取出样本。(7)分别对三组样本进行大体观察,并进行组织学检测和免疫组化分析。【结果】(1)ECM支架和FECM支架高度2mm,直径6mm。肉眼观察发现ECM支架表面比较粗糙,间隙较大,支架边缘毛糙,而FECM支架表面比较细腻,间隙较小,支架边缘也更加光滑。ECM支架的孔径为239.082±76.703μm,FECM支架的孔径为69.492±17.316μm。(2)通过DAPI染色观察可见两种支架内细胞成分消失,脱细胞比较彻底。(3)ECM支架的孔隙率为92.11±0.92%,吸水率为2156.3±276.9%,FECM支架的孔隙率为83.63±0.27%,吸水率为1763.2±103.1%。(4)CCK-8细胞毒性试验证明两种支架对骨髓间充质干细胞(BMSCs)无毒性。(5)ECM支架的细胞接种率为81.4%,黏附率为73.1%;FECM支架的细胞接种率为89.6%,黏附率为80.8%。(6)大体观察发现实验组细胞-支架复合物圆润饱满,色泽均匀呈类似正常软骨的瓷白色。对照组细胞-支架复合物形状不规则,出现了萎缩塌陷。实验组和阳性对照组细胞-支架复合物外形都比较饱满,表面光滑,色泽均一。(7)HE染色以及番红O染色组织学观察:实验组和阳性对照组细胞-支架复合物切片显示软骨细胞有大量增殖,均匀分散在视野中,细胞被大量细胞基质所包裹,形成软骨陷窝,细胞基质中番红O染色染色较深;对照组细胞-支架复合物切片中,细胞密度稀疏,排列分散,基质分布不连续,同时其细胞基质中番红O染色较浅。(8)免疫组织化学染色观察:实验组和阳性对照组细胞-支架复合物切片的Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性,且实验组染色较深,分布广阔均匀,而这两组中Ⅰ型胶原染色浅,分布较少。对照组细胞-支架复合物中Ⅱ型胶原染色浅,Ⅰ型胶原染色较深。【结论】我们应用改良方法制备的软骨细胞外基质支架外形规则,其物理微结构更加整齐均一,有利于细胞的粘附、生长和增殖。并且此支架不需要外源性TGF-β1就可以有效地诱导BMSCs向软骨细胞分化,能够构建出高质量的组织工程软骨。