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实验目的：
1、通过MC3T3-E1细胞的传代及其培养，明确其细胞形态变化和生长分化规律;
2、探讨不同浓度和不同给药方式的甲状旁腺素(PTH)对MC3T3-E1细胞成骨分化的不同影响;
3、明确间歇性PTH对MC3T3-E1细胞成骨分化的促进作用;
4、明确PTH对Wnt/β-catenin信号通路的激活作用;
5、验证Wnt/β-catenin信号通路是否具有介导PTH促进成骨细胞分化的作用，在细胞分子水平阐明PTH的作用机制，为临床骨质疏松症和骨折愈合的治疗提供新思路和重要依据。
实验方法：
1、细胞培养:传代培养MC3T3-E1细胞，以2.5×105/孔的细胞浓度种植于6孔板内，细胞生长于α-MEM培养液中，内加10％胎牛血清、1％青霉素/庆大霉素溶液、5mM L-Glutamine，置于37℃、5％ CO2饱和湿度培养箱中孵育，至细胞70％-80％融合时，开始以不同浓度和给药方式的PTH处理细胞。
2、PTH处理和细胞分组:对于间歇性给药，每日以PTH处理细胞6h，每48h为1个循环，每2d收集细胞，进行成骨因子基因检测。对于持续性给药，每日以PTH处理细胞24h，每24h为1个循环，每2d收集细胞，进行成骨因子基因检测。并根据各个实验的不同，将细胞分为不同实验组:盐水对照组、PTH组、β-cateninsiRNA组和β-catenin siRNA+PTH组。
3、转染实验:Topflash firefy荧光素酶质粒(500ng/well)和SV-40 Renilla(20ng/well)荧光素酶质粒共转染细胞，以双荧光素酶报告基因检测方法，检测Topflash荧光素酶的活性。应用β-catenin siRNA寡核苷酸，孵育细胞36小时，然后以PTH处理6天，进行相应RNA、蛋白及碱性磷酸酶(ALP)染色实验。
4、Real-time PCR实验:用RNeasy试剂盒提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，然后稀释3倍，取1μl稀释后的cDNA进行Real-timePCR反应，以检测成骨因子mRNA的表达。在同一次反应中，各组均设3个平行重复。以β-actin为内参基因，通过RotorGene分析软件进行定量分析。
5、碱性磷酸酶染色:于室温以10％中性福尔马林固定细胞30min;吸除福尔马林，PBS清洗2次，加入ALP one-step染色剂，于37℃孵育45min，进行ALP染色检查，以检测细胞内碱性磷酸酶的活性。
6、Alizarin Red染色:于4℃以10％中性福尔马林固定细胞20min;吸除福尔马林，蒸馏水清洗3次，加入Alizarin Red染色剂，于室温下染色30min，进行Alizarin Red染色检查，以检测细胞内成骨钙化的作用。
7、免疫荧光检测:于室温下以4％中性福尔马林固定细胞15min，0.1％TritonX-100通透细胞膜，0.05％ Tween20清洗细胞3次，2.5％BSA封闭60min，分别加入一抗和二抗后，固定，进行免疫荧光检测。
8、Westernblot实验:以Golden lysis buffer液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每泳道上样40μg，经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白，转膜，加入一抗和二抗后，显影照相，以β-actin为内参基因，进行Western Blot实验，以检测细胞内成骨因子蛋白的表达。
9、统计学分析:全部数据以均数±标准差表示，用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，当P＜0.05时认为有统计学意义。
实验结果：
1、MC3T3-E1细胞经传代培养1日后即出现细胞贴壁现象，细胞数量较少，形态不规则;培养3日细胞数量略有增加，但形态仍不规则;培养5日细胞数量明显增加，形态逐渐变为长梭形，可见少量细胞融合;培养7日细胞数量继续明显增加，形态逐渐变为长椭圆形，达到70％-80％细胞融合;
2、MC3T3-E1细胞随时间增长其细胞内ALP、OC、Bsp和Runx2等成骨因子mRNA的表达逐渐增强，碱性磷酸酶染色强度逐渐增强;
3、经间歇性1nM浓度的PTH和10nM浓度的PTH处理后，MC3T3-E1细胞内ALP、OC、Bsp和Runx2等各个成骨因子mRNA的表达显著增强(P＜0.05)，碱性磷酸酶染色和Alizarin Red染色强度明显增强，以10nM浓度的PTH效果更明显;100nM浓度的PTH处理后，MC3T3-E1细胞内ALP、OC、Bsp和Runx2等各个成骨因子mRNA的表达没有明显增强(P＞0.05);碱性磷酸酶染色和Alizarin Red染色强度也没有增强;
4、持续性10nM浓度的PTH处理后，MC3T3-E1细胞内ALP、OC、Bsp、Osx、Col1a1和Runx2等各个成骨因子mRNA的表达显著降低(P＜0.05);碱性磷酸酶染色和Alizarin Red染色强度也明显降低;免疫荧光检测显示Osx蛋白的表达明显降低;OC、Bsp、Col1a1和Runx2等成骨因子蛋白的表达也明显降低;
5、经间歇PTH处理后，MC3T3-E1细胞内ALP、OC、Bsp和Runx2等各个成骨因子mRNA和蛋白的表达显著增强，于处理第6日时达到峰值;经间断PTH处理后，碱性磷酸酶的活性也显著增强(P＜0.05);
6、PTH显著增强MC3T3-E1细胞内β-catenin mRNA和蛋白的表达，经PTH处理后细胞内Topflash荧光素酶的活性显著增强(P＜0.05)，PTH对Wnt信号通路具有明显的激活作用;
7、经β-catenin siRNA转染后，MC3T3-E1细胞内β-catenin蛋白的表达受到明显抑制，虽经PTH再次处理后，抑制作用没有明显逆转，表明siRNA转染已经成功;
8、经β-catenin siRNA转染后，MC3T3-E1细胞内ALP、OC、Bsp和Runx2等各个成骨因子mRNA和蛋白的表达显著降低，且经PTH处理后，此种作用未得到逆转;碱性磷酸酶染色强度也于β-catenin siRNA转染后显著降低，且经PTH处理后无逆转(P＜0.05)。
结论：
1、MC3T3-E1细胞有自发向成骨细胞方向分化的趋势;
2、PTH的作用具有剂量依赖性，10nM浓度的PTH具有最大作用效果;
3、持续性给与PTH抑制MC3T3-E1向成骨细胞方向分化，而间断给与PTH则可以明显促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞方向分化，此种作用于PTH处理后第6日时达到峰值;
4、PTH显著增强MC3T3-E1细胞内β-catenin mRNA和蛋白的表达，并显著提高Wnt/β-catenin信号通路的活性;
5、经β-catenin siRNA转染后，MC3T3-E1细胞内β-catenin基因功能出现沉默作用，Wnt/β-catenin信号通路的活性受到抑制作用，且此种抑制作用不能为PTH逆转;
6、β-catenin基因沉默后，MC3T3-E1细胞成骨分化的作用受到一定程度的抑制，PTH失去其促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞方向分化的作用。因此，Wnt/β-catenin信号通路在PTH促进成骨细胞分化的过程中，发挥着重要的介导作用;PTH通过提升Wnt/β-catenin信号通路的功能而发挥其促进成骨细胞分化的作用。