论文部分内容阅读
农药作为防治农作物病虫草害的主要药剂,在国民经济的发展中发挥着举足轻重的作用。在新农药创制过程中,新靶标的发现对于新农药的研发具有重要意义。新的药物作用靶点一旦被发现,往往成为一系列新药创制的突破口,具有重要的社会效益和经济效益,因此对农药作用靶点的研发已成为当前新农药创制的重要方向之一。苯基噁二唑砜类化合物作为一类结构新颖且具有广谱活性的杀菌剂,其对多种重大植物病原细菌如水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）、柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac）以及烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）等均表现出高效的抑菌活性,因此对该类化合物的设计合成与生物活性研究受到了广泛的关注。然而遗憾的是,到目前为止该类化合物的作用靶标还未知,作用机制尚不明确,导致对其结构的进一步开发与利用面临极大的挑战。为研究苯基噁二唑砜类化合物的作用靶标,从分子水平阐明其作用机制,本论文在2-甲磺酰基-5-（4-氟苯基）-1,3,4-噁二唑（甲磺酰菌唑,“JHXJZ”）母体结构的基础上,通过对其结构修饰后合成了一系列高活性的分子探针,利用分子探针技术开展了JHXJZ在植物病原细菌中的靶标研究工作,并通过化学蛋白质组学技术首次从活细胞水平上揭示了二氢硫辛酸琥珀酰转移酶（DLST）为该类化合物在Xoo和Xac中的主要作用靶标,进一步通过定量蛋白质组学手段阐明了DLST可能通过调控赖氨酸琥珀酰修饰水平从而影响细胞的能量代谢过程。本研究同时初步明确了JHXJZ在烟草青枯病菌中与多个靶标相互作用。本论文建立了基于活性分子探针技术的农药靶标研究平台,并揭示DLST为新的农药作用靶点,从分子水平上基本阐明了苯基噁二唑砜类化合物的作用机制。DLST的发现有望为新型、高效、绿色杀菌剂的创制提供重要理论指导。现将本论文工作总结如下:（1）以甲磺酰菌唑为母体,通过对其结构中的苯环部分进行修饰后合成了6个可进行“点击化学”（Click Chemistry）反应的砜类小分子探针（Probe 1-6）和2个阴性对照探针NP 1-2并通过核磁共振氢谱（1H NMR）、核磁共振碳谱(13C NMR)及高分辨质谱（HRMS）对其进行了结构确证。（2）以Xoo、Xac和烟草青枯病菌为研究对象,采用浑浊度法对Probe 1-6进行了离体抗细菌活性筛选。活性测试结果表明,Probe 1、2和3对三种细菌均表现出良好的的抑菌活性,其中Probe 1对Xoo的抑菌活性(EC50=3.58μM)与JHXJZ(EC50=3.51μM)相当,Probe 2对Xac的抑菌活性(EC50=7.06μM)略优于JHXJZ(EC50=8.59μM),Probe 3对烟草青枯病菌的抑菌活性(EC50=84.67μM)略低于JHXJZ(EC50=65.06μM),Probe 1、2和3均具备活性分子探针的基本条件。（3）利用Probe 1开展了对Xoo的靶标研究工作。将Probe 1分别对Xoo进行离体和活体标记后发现p45蛋白为Probe 1的主要作用靶标,进一步通过竞争实验证明p45为Probe 1的特异性靶标。同时利用阴性对照探针NP 1发现甲磺酰基在探针与靶标的相互作用过程中发挥着关键作用。采用pull down手段实现了对p45蛋白的富集纯化,经切胶、酶解后通过质谱鉴定为二氢硫辛酸琥珀酰转移酶（DLST）。为进一步验证靶标,一方面将DLST进行体外重组表达后通过体外互作用分析进行了验证,另一方面通过DLST抗体的Western blot实验进一步证实DLST为Probe 1在Xoo中的特异性靶标。（4）利用Probe 2开展了对Xac的靶标研究工作。将Probe 2对Xac分别进行离体及活体标记后发现Probe 2在Xac中的主要作用靶标为p45蛋白,同时通过竞争性实验发现p45为Probe 2的特异性靶标。经pull down富集纯化后通过质谱鉴定为二氢硫辛酸琥珀酰转移酶（DLST）,并通过抗体的Western blot实验对靶标进行了验证。（5）利用Probe 3开展了对烟草青枯病菌的靶标研究工作。将Probe 3对烟草青枯病菌分别进行离体和活体标记后发现Probe 3与多个蛋白相互作用,并通过竞争性证明标记蛋白为特异性靶标。采用pull down手段对靶标进行富集纯化后通过on-bead digestion及质谱分析发现其特异性靶标主要有65个,并通过Western blot实验对其中3个高度富集的靶标DLST、甘氨酸裂解系统H蛋白（glycine cleavage system H protein,GCSH）和巯基过氧化物酶（thiol peroxidase,TPX）进行了验证。同时GO分析结果表明靶标主要与代谢进程和细胞进程相关,分别占43%和37%,进一步通过KEGG富集分析发现靶标主要参与了核糖体等相关代谢通路。（6）通过采用非标定量、琥珀酰化富集技术以及高分辨率液相色谱-质谱联用的定量蛋白质组学研究方法对甲磺酰菌唑处理后的Xoo进行了琥珀酰化蛋白质组学的定量研究。经质谱分析共鉴定到765个蛋白上的2860个位点存在赖氨酸琥珀酰修饰,并且597个蛋白的2052个位点可用于定量研究。其中,412（69%）个蛋白的1332（65%）个位点的琥珀酰修饰水平下调2倍以上（p-value<0.05）,表明当DLST活性被抑制后将导致琥珀修饰水平显著降低即DLST与赖氨酸琥珀酰修饰水平密切相关。从GO注释结果来看,差异修饰蛋白主要参与代谢进程（34%）和细胞进程（30%）两大类生物学过程,主要与结合（45%）和催化活性（43%）两大类分子功能相关,表明赖氨酸琥珀酰修饰广泛参与Xoo细胞内生物功能的调控过程。进一步通过GO富集分析表明与代谢进程和结合相关的琥珀酰修饰蛋白被显著富集,同时KEGG富集分析结果显示糖酵解过程相关蛋白被显著富集,表明差异修饰蛋白可能与能量代谢相关。最后将JHXJZ处理Xoo细胞后发现ATP含量显著下降40%以上,这一结果与KEGG的富集结果相吻合,进一步表明能量代谢过程被干扰。定量蛋白质组学的研究结果表明DLST可能通过参与赖氨酸琥珀酰修饰水平的调控从而影响能量代谢过程,同时也表明JHXJZ可作为一种有效的工具小分子来研究DLST的功能。